昆虫细胞大规模培养和杆状病毒的生产
钙离子拮抗剂对Sf-9细胞吸收caz+、Mgz+的影响
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度、大规模培养，是昆虫细胞大规模培养的一个 新的对象[5]。
用 Sf-9 细胞进行的钙通道阻滞剂的试验，试 图阐明脊椎动物钙通道阻滞剂对无脊椎动物昆虫 细胞膜钙离子通道的影响。通过测定培养上清液 钙、镁离子残留量，推断 Sf-9 细胞对钙、镁离子 吸收量的变化。该实验为动物细胞生成代谢过程 中对钙、镁离子吸收的共性问题进行了有益的探 讨。
摘 要：通过观察钙离子拮抗剂对秋粘夜蛾蛹的卵细胞 （sf-9)吸收 Ca2+、Mg2+ 浓度的影响，旨在探讨
不同钙通道阻滞剂对细胞 Ca2+ 的定性、定量研究以及对昆虫细胞生理生化的影响。采用细胞培养、离心、
原子吸收光谱测定等方法，研究不同的钙离子拮抗剂：Nife、Nimo、Nitren 作用于 SF-9 细胞，分别测定
. A1.l2.l1 细Ri胞g培ht养s Reserved.
Sf-9 细胞接种于 Grace 培养液中 ，置 27℃、 饱和湿度的培养箱中，吹打传代，并计数。 1.2.2 原子吸收光谱法测定 Ca2+、Mg2+ 的浓度
Sf-9 细 胞 以 6 ×105 个 /ml 密 度 2 ml 分 成 3
Sf-9 昆虫细胞系来自秋粘夜蛾的蛹卵巢组织， 通常用于分离和重组杆状病毒繁殖种群和生产重 组蛋白。其非贴壁依赖性、培养温度低、无需 CO2、最适 pH 值为 6.2 （略偏酸性），很适合高密
作者简介：李文楚 （1966-），副教授，E-mail: liwenchu@
第2期
钙离子拮抗剂对 Sf-9 细胞吸收 Ca2+、Mg2+ 的影响
纯培养液与钙离子拮抗剂处理并滤掉细胞后的培养液中的钙镁离子浓度，通过计算两者的浓度差值，得出
SF-9 细胞在一定时间内吸收的钙镁离子量，并进行比较。原子吸收光谱法测定的结果显示：经钙离子拮
昆虫sf9细胞培养
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此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
杆状病毒-课件
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治 的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。 与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具 有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在 环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害， 不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时 具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推 荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等 基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达 早期时相向晚期基因表达的过渡 晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制 周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器 为病毒DNA复制提供必需条件 突破或阻断宿主细胞防御机制 提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV
昆虫sf9细胞培养
Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：培养最低密度：0.6/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×-2.5×细胞/mL后将密度调整至0.7×-1.0×细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×个/mL或保持密度高于1×个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。
移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。
动物细胞大规模培养技术培养流程
动物细胞大规模培养技术培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
昆虫细胞表达系统
昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。
昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。
将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。
杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。
杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。
昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。
因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。
昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。
细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。
而昆虫细胞表达系统具有很多优点：(1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统；(2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构；(3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；(4)昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。
高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；(5)可表达非常大的外源性基因（~200kD）而不至于影响本身的增殖；(6)具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；(7)通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因；(8)对脊椎动物是安全的，杆状病毒属于昆虫病毒，有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性，而且经重组后的病毒因失去多角体保护而使其在自然界的生存能力很弱，被认为是安全的载体。
动物细胞大规模培养方法及其应用
动物细胞的大 规模培养
动物细胞大规模培养技术失建立在贴壁培养法 和悬浮培养法基础上,再融合了固定化细胞、填充 床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展 起来的.
主要包括：
悬浮培养 微载体培养 微囊化培养 中空纤维法
• 利用大规模培养哺乳类细胞是 一项重要的生产生物制品的技 术,包括疫苗、干扰素、激素、 生长因子和单抗等,具有很高的 经济和社会效益.
膜由聚丙烯或其它材料制成,它被加工成多孔的管.在多孔管内的气体压力不能超过 鼓泡压力,即气泡在膜外表面出现的静止内压.对于不湿润的硫水膜,相对于水的气 泡压力约在13X10’Pa.上述这一要求是容易实现的,即加在管上的压力
应比管内流动压力降和气泡压力的总和高出10％.在那种情况下,就可以形成管外的 气掖界面层.即使当多孔管运动时单独的气泡不出现,其传质的情况基本上与气体鼓 泡相似.
这种反应器传质性能很好,并在循环系统中 采用膜气体交换器,能快速提供
给高密度细胞所需的氧,同时排除代谢产物 如二氧化碳<c02>.反应器中的液体流速能 足以使细胞微粒悬浮,却不会损坏脆弱的细 胞；培养的细胞密度同且细胞长时间停留 在反应器中,细胞生长环境可方便地调控.对 贴壁与非贴壁细胞均适用.放大也容易.
动物细胞培养生产具有重要医用价值的 酶、生长因子、疫苗和单抗等
1、优化细胞培养环境 2、改变细胞特性 3、提高产品的产率
1、细胞培养环境
• 细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细 胞密度的主要限制因素.
• 体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制 细胞生长的主要因素之一.氨的积聚使细胞 内UDP氨基己糖<UDP-N-乙酰葡糖胺和 UDP-N-乙酰半乳糖胺>增加,影响细胞的生 长及蛋白的糖基化过程.