Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor
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非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
昆虫杆状病毒表达系统(BEVS)
姓名：宋志瑞 专业：生物工程 学号： 2015304120207
NO.1
BEVS 简介
BEVS简介
昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVS)是基于昆虫杆状病 毒及其宿主细胞建立起来的表达体系；是继大肠杆菌， 酵母，哺乳动物细胞表达系统建立起来的，始于上世纪 80年代。
NO.2
BEVS 优点
2
Bac-to-Bac
3
BaculoDirect源自BacPAKBac-to-Bac
BaculoDirect
三大体系的区别
NO.5
BEVS常用宿主
常用宿主
Thanks
√
√ √ Sometimes Sometimes
Glycosylation
Acylation
√
√
表达高
加工 修饰
安全
B E VS
高效
容量大
NO.3
BEVS 原件
BEVS原件
1. 转移载体 2. 杆状病毒（AcNPV) 3. 宿主（培养细胞或虫体）
NO.4
BEVS三大系统
BEVS三大系统
1
BacPAK
BEVS优点
Features Simple to use Protein size Multiple gene expression Signal peptide cleavage BEVS √ unlimited √ √ Bacterial √ <100kD
Intron splicing
Functional protein Phosphorylation
Bac-to-Bac_表达系统精简
Bac-to-Bac 表达系统I. pFastBac-X重组质粒的构建利用分子生物学技术构建所需的pFastBac重组质粒,以DH5α为宿主,进行扩增.(以下以pFastBac-X为例进行说明.II. pFastBac-x重组质粒的转座步骤：1. 制备LB琼脂平板。
LB培养液（含Agar）：胰蛋白冻10g/l，Nacl 10g/l，酵母提取物5g/l，Agar 15g/l 高压灭菌后，培养基温度下降至60℃左右迅速加入下列成分：卡那霉素50ug/ml庆大霉素7ug/ml四环素10ug/mlBluo-gal 100ug/mlIPTG 40ug/ml各成分混匀后，乘热在每块平板中加入约20ml培养基，待凝固后放置37℃烘箱干燥产生的水汽。
2. 取出DH10BacTM感受态细胞冰上融解。
3. 用移液枪吸取100ulDH10BacTM感受态细胞于1.5ml EP管。
4. 轻轻加入1ng（约5ul）重组质粒X于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀。
5. 冰上放置30min。
6. 42℃循环水浴静止45秒。
7. 快速放置冰上2min。
8. 在上述管中加入900ul S.O.C.培养基。
9. 将EP管置于37℃摇床（225rpm）4h。
10. 用S.O.C.稀释上述细胞至10－1、10－2、10－3。
11. 在每块LB培养基中加入上述稀释液100ul，涂布均匀。
12. 37℃培养24－48h。
（单克隆很小，24h前很难分辨是否为蓝色克隆）注：1）1、3、4、8、10、11在超净台内进行。
2）用X－gal代替Bluo-gal会降低颜色浓度。
真正的白色克隆在菌落长得较大时还是呈白色，建议在黑色背景下进行挑选。
III. 重组Bacmid DNA的分离提取（在提取前，可以在含Bluo-gal的LB琼脂平板上划板进一步确认）溶液配置：溶液Ⅰ：Tris-Hcl(15Mm) 0.119gEDTA (10Mm) 0.187gRnase (100ug/ml) 0.5ml(贮备液10mg/ml)用纯水溶解并定容至50ml（调pH8.0）溶液Ⅱ：NaOH 0.2NSDS 1%溶液Ⅲ：醋酸钾（3M）14.7g溶解定容至50ml，pH5.5TE溶液：1. 挑取白色克隆于2mlLB培养基（含50ug/ml卡那霉素、7ug/ml庆大霉素、10ug/ml四环素），37℃摇床250－300rpm培养24h以上。
利用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ
ｐ ａ Ｂ ｃ Ｔ 载体， Ｆｓ ａＨ ｂ ｔ 大肠杆菌 Ｄ ５ ，Ｈ ０ ａＴ Ｈ ａ Ｄ １Ｂ ｃ ， Ｍ Ｂ Ｎ昆虫细胞 ， ｍ 由本实验室保存。 ａ Ｈ Ｉ， ｉ １ Ｂｍ Ｈｎ １ ｄ１
等限制性内切酶，４Ｄ Ａ连接酶 ， Ｔ Ｎ 质粒柱抽试剂盒 ，
费建明 １ 吴 岩 ，占鹏飞 １施 国方 １ 王文兵 ２ ， ， ，
（． １浙江省湖州市农业科学研究院 ， 浙江 湖州 ３ ３ ０ ；２ 江苏大学生命科学研究院， １０ ０ ． 江苏 镇江 ２２ １ ） １０ ３
摘
要 ： 厂天冬酰胺酶（－ ｓａａｉａｅＩ Ａ Ｐ 可以通过 降解 Ｌ 天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞 中蛋白质的正常合成 ， Ｉ Ｌ ａｐ ｒｇ ｓ ， ＿ Ｓ ） ｎ ， ＿ 导
致肿瘤细胞的死亡。 通过杆状病毒的 Ｂ ｃｔ －ａ 方法 ， ａ－ｏ Ｂ ｃ － 将大肠杆菌的 ａｐ 因在家蚕杆状病毒 中表达 ， ｓ基 其活性较原核表 达有 明显提高 ， 达到 ２ ０ ／ 。为利用家蚕生物反应器生产该蛋 白提供 了依据 。 ８０ ｍｇ 关键词： 家蚕 ； 多角体 ； － Ｌ 天冬酰胺酶； － 大肠杆菌
（． ｅｉ ｈ ｒ ＲｅｅｒｈＩｓｉ ｔ， ｚｏ ｃ ｄ ｍ ｇｉ ｌ ｒｌ ｃ ｎ ｅ， ｚｏ １ ０ ０ Ｃ ｉａ １ Ｓ ｒ ｕ ｕｅ ｓａｃ ｔｕｅ Ｈｕｈ ｕＡ ａ ｅ ｙｏ ｒ ｕｔ ａ Ｓ ｉ ｃｓ Ｈｕｈ ｕ３ ３ ０ ， ｈｎ ； ｃ ｎ ｔ ｆＡ ｃ ｕ ｅ
ｗｉｈ ｔ ｅ ｂａ ｕ ｖ ｒ ｃｔ ｃｓ ｓｅ ｔ ｈ ｃ ｌ ｉｕｓＢａ ｏ Ｂａ ｙ ｔ ｍ
ＦＥＩＪａ － ｉ ｇ． Ｕ ｎ， ｉｎ ｍ ｎ Ｗ Ｙａ ２ＺＨ ＡＮ ｅ ｇ ｆＰ Ｓ ｏ ｆ ｎ １Ｗ ＡＮＧ ｅ － ｉｇ Ｐ ｎ － ｅ ， ＨＩＧｕ － ａ ｇ， Ｗ ｎ ｂｎ
bac-to-bac expression system
Thank you!
Bac-to-Bac expression system
专业：生物化学与分子生物学 姓名：蒋琢璞 学号：200730200
简介
杆状病毒表达系统（Baculovirous Expression Vector System,BEVS）与细菌， 酵母，哺乳动物细胞一起被公认为当今世界 的基因工程的四大表达系统。它作为一种新 型的表达系统，因为其许多特有的优势特点， 逐渐引起了人们越来越多的关注
基本原理
AcNPV为环状双链的DNA病毒，分子量在 90～130kd，是目前应用最广泛的杆状病毒 表达载体。其中的多角体蛋白(Polyhedrin) 对于感染过程不是必需的，因此可以用一 个外源基因来代替多角体蛋白基因，用这 样一个重组的杆状病毒来感染昆虫细胞， 从而实现目的蛋白的高效表达。
为了在昆虫细胞中表达外源基因，重组病毒 质粒的构建和纯化筛选，常常需要依赖基 本的转染和斑点分析方法，这个过程通常 会花费4～6周。然而，如果利用一个既能 在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行复制 的，又能感染敏感的鳞翅目昆虫细胞的病 毒穿梭载体（bacmid）,那么就可以将周期 降低到几天。
特点
能对高效表达的蛋白质进行较完善的翻译后加工，如糖基 化，磷酸化，酰基化，信号肽的切除等； 与其他真和细胞表达系统相比能获得重组蛋白的高水平表 达，最高甚至可达到细胞总蛋白的50%； 对脊椎动物无感染性，并且也已经证明它们的启动子在大 多数的哺乳动物细胞中也是没有活性的，因此这对于表达 一些致癌基因和潜在的毒蛋白比其他的表达系统更有优势； 能容纳大分子片段的插入和表达； 能同时在一个细胞和载体上表达多个外源基因； 能保证高表达的外源蛋白在细胞内进行正确的折叠，二硫 键的搭配等。
Bac to Bac
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是一种快速、高效产生重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）的技术（Luckow et al., 1993），利用细菌转座子原理，在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建，取名为Bac-to-Bac表达系统，意即从细菌（bacterium）到杆状病毒（baculovirus），革命性地改变了重组昆虫杆状病毒的构建方法。
其基本原理为：将一个改造后的AcNPV基因组转化入大肠杆菌，使它像普通质粒一样能在细菌中复制（由于太大，只限单拷贝），将其称之为杆状病毒穿梭载体（baculovirus shuttle vector，又称病毒质粒baculovirus plasmid，将其首尾合写而成为Bacmid），通过位点特异性转座，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。
杆状病毒穿梭载体Bacmid含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性选择标记基因及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。
在lacZα基因的N氨基末端插入一小段含有细菌转座子Tn7整合所需的靶位点（mini-att Tn7），但它的插入不影响lacZα基因的表达阅读框。
将杆状病毒穿梭载体（130kb）转化入大肠杆菌DH10β,获得转化子将其命名为DH10Bac。
因此，杆状病毒穿梭载体像一个大质粒一样，可以在大肠杆菌中增殖并使细菌细胞获得卡那霉素抗性，且与存在与受体菌染色体上的lacZα缺失产生互补，在IPTG诱导和X-gal或Blue-gal生色底物存在下转化体产生蓝斑（lacZ+）。
重组Bacmid通过pFASTBAC供体质粒（donor plasmid）上的mini-Tn7转座子，在另一个辅助质粒（helper plasmid，13.2kb）的功能作用下将外源目的基因插入到Bacmid中来完成。
Helper plasmid表达转座酶并含有四环素（tetracycline）抗性基因。
pFASTBAC系列供体质粒具有共同的特征：每个质粒都含有杆状病毒启动子（polh或p10启动子），在mini-Tn7左右臂间由一个完整的表达框，包括庆大霉素（gentamincin）抗性基因、杆状病毒启动子、多克隆位点及SV40 poly(A)。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定) PPT
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周
2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent
3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变慢 或不增殖
脱落 或
融合(VSV/G)
裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状 病毒滴度测定)
杆
昆虫细胞的培养
状
病 重组pFastBac质粒的构建
毒
表
重组Bacmid的产生与鉴定
达
获得重组杆状病毒
系
统
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
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Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。
此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。
*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。
*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。
Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。
虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。
我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。
Bac-to-Bac表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。
基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac TM菌株。
基于pFastBac TM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7*第二个主要结构是Ecoli的DH10Bac TM品系，用来作为pFastBac TM菌株的宿主。
DH10Bac TM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。
一旦pFastBac TM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBac TM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。
这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。
如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。
在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。
杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括：*一个低拷贝的微型F复制子*卡那霉素的抗性标记*一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。
插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。
杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG 存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。
这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。
图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达实验轮廓：流程：下图揭示了表达目的基因的一般步骤1、pFastBac donor 质粒（步骤：目的基因的克隆）得到2、pFastBac重组体（转化至DN10Bac细胞（含有杆粒和helper））得到3、含有重组杆粒的Ecoli细胞（重新划线）得到4、验证过的含有重组杆粒的Ecoli细胞（过夜培养，分离重组杆粒DNA）得到5、重组杆粒DNA （使用Cellfectin试剂感染细胞）得到6、P1 重组杆状病毒株（＞106pfu/ml）（感染昆虫细胞扩增病毒）得到7、P2 重组杆状病毒株（＞107pfu/ml）（滴定感染昆虫细胞）得到8、蛋白的表达培养昆虫细胞：一般指导：介绍：对于您的杆状病毒转移菌，我们推荐使用Sf9和Sf21昆虫细胞作为宿主。
在开始你的转化试验和表达之前，确定你有收获的Sf9和Sf21，并将其冻存。
使用无血清的介质：昆虫细胞可能在无血清的条件下收获。
我们推荐使用Sf900 ⅡSFM。
Sf900 ⅡSFM 对于维持Sf9 和Sf21以及对于大规模生产重组蛋白，都是无蛋白的最优的介质。
昆虫细胞培养参考指导：维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下冷冻细胞使用无血清的介质按比例增加细胞产量一般指导：昆虫细胞对于环境很敏感，此外化学和营养因素，物理因素都可以影响昆虫细胞的成长。
需要优化以得到最大产量。
考虑以下培养条件：*温度：细胞的感染和成长的最适合范围是27-28度*PH：对于许多培养系统6.1-6.4时合适的范围。
Sf900 ⅡSFM在此范围内支持一般的空气和开盖培养*同渗重摩：鳞翅类细胞使用介质的最优同渗重摩是345-380 mOsm/kg*通风：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。
积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%*剪切力：悬浮培养产生机械剪切力。
生长的昆虫细胞在含有血清的介质中（10%-20% FBS），对于细胞的剪切力一般会得到足够的保护。
如果你的细胞在无血清条件下生长，加入剪切力保护剂例如PluronicF-68。
注意：在Sf900 ⅡSFM中生长的细胞不需要加入剪切力保护剂。
转染的细胞：你需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。
产生重组的pFastBac TM菌株（Vector）一般信息：介绍：为了产生包含目的基因的重组质粒，使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，你需要使用限制酶消化和连接，将你的目的基因克隆进入pFastBac 菌的其中一种。
一般分子生物学技术：为了帮助限制酶消化和连接DNA的序列，需要其他一般的分子生物学技术扩增和保存质粒：pFastBac菌种和他的相应的表达对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因，可以使用Ecoli进行Amp筛选。
为了扩增和保存pFastBac和pFastBac对照质粒，使用以下方法：1、使用载体株系感染一个recA ,endA Ecoli株，例如Top10，DH10B或者DH5α2、在含有100ug/ml Amp的LB琼脂糖平板选择转化株。
3、选择含有质粒的转化子制备甘油菌以便长期保存克隆进入pFastBac TM1介绍：为了帮助你设计策略克隆你的目的基因进入pFastBac TM1，参考以下建议和表格克隆考虑事项：pFastBac TM1菌株是非融合菌株（无融合标签）。
为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有：*一个ATG起始密码子用于转录起始*一个终止密码子。
注意：终止密码子包含在所有三个阅读框中的多克隆位点中注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。
一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。
蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。
pFastBac TM1的多克隆位点：下图是pFastBac TM1的多克隆位点。
限制位点标出来以便显示实际切刻位点。
潜在的终止密码子下划线表示。
pFastBac TM1的全序列可以从网站下载。
pFastBac TM1的图谱和描述见后缀克隆进入pFastBac TM HT A，B，C介绍：pFastBac TM HT载体由三个读码框（A，B，C）提供的多克隆位点从而实现克隆目的基因，并且在N 端带有6XHis。
克隆：pFastBac TM HT菌株是融合菌株。
为了保证表达重组蛋白，你必须：*克隆你的基因要带有ATG，位于4050-4052碱基对间。
这个将会产生融合表达，带有6XHis标签，可以用TEV切除*你的插入要含有终止密码注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。
一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。
蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测pFastBac TM HT A的多克隆位点：下图是pFastBac TM HT A的多克隆位点。
其实ATG用黑体标出。
限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。
pFastBac TM HT B的多克隆位点：下图是pFastBac TM HT A的多克隆位点。
其实ATG用黑体标出。
限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。
框住的核苷酸显示出的是易变区域。
pFastBac TM HT C的多克隆位点：下图是pFastBac TM HT A的多克隆位点。
其实ATG用黑体标出。
限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。
框住的核苷酸显示出的是易变区域。
注意pFastBac TM HT C在Xba Ⅰ位点内有一个终止密码子，他在N端标签框内。
确定你的基因的5`端是在Xba Ⅰ位点上游开始。
克隆进入pFastBac TM Dual介绍：pFastBac TM Dual包含两个多克隆位点，可以同时表达两个异源基因，一个通过PH启动子控制，另一个通过P10启动子控制。
参见下列建议以便有助于你的基因克隆克隆事项：pFastBac TM Dual是一个非融合载体。
为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有以下两点*一个ATG起始密码子*如果你不使用多克隆位点中的终止密码子，就必须要有一个终止密码子注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。
一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。
对于插入克隆上游的聚乙烯启动子，注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。
PH启动子下游的多克隆位点：下图是pFastBac TM Dual中PH启动子下游的多克隆位点的图示。