细胞培养技术考题

1.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞核血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。（在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。）

2.谷氨酰胺在细胞培养中起什么作用及使用方法？作用：几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。使用方法：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

3.如何用台盼兰计数活细胞？正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。（用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。）

4.如何消除组织培养的污染？确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。（一）认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌。（二）改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌。（三）操作人员严格遵守无菌操作规程。（四）培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量。（五）在培养基中加入适量的抗生素。（六）利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗。（七）利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长。（八）减少培养基中的某些有机成分，可抑制微生物的生长繁殖。

5.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

6.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。由–20℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

7.二价离子会抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？二价离子能够抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。在胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

8. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？液体培养基冷冻后再经融化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往会变碱，某些成分溶解也会受到影响，对细胞生长不利，故培养液一定要存放在冷藏条件下。

9.培养用液pH对细胞生长的影响？由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受能力强。但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。

10.MTT法的原理？又称细胞增殖检测活细胞线粒体中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定甲臢染料的吸光值，可间接的反应活细胞数量。

细胞培养实验室的基本设备有哪些常用的基本设备：1、仪器：显微镜、培养箱、干燥箱、水纯化

装置、冰箱或冷藏箱、细胞冷冻储存器、离心机、天平、消毒器、滤器；2、基培养用器皿：培养瓶、培养皿、多孔培养板；3、培养操作有关器皿：贮液瓶、吸管、加样器等；4、用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。特殊设备：酶联免疫检测仪，超低温冰箱，旋转培养器，荧光显微镜，流式细胞仪及其他用于检测细胞培养条件的各种仪器。

（【实验设备】：无菌操作室(包括更衣间，缓冲间和操作间）准备室的设备：三蒸水器，酸缸，烘箱，高压锅，储品柜（放置未消毒物品），储品规（放置消毒过的物品），包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品），PH计（测量培养用液PH值），磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液），滤器及泵。培养室的设备：液氮罐，储品柜（存放杂物），日光灯和紫外灯，空气净化器系统，低温冰箱（-80℃），空调，二氧化碳缸瓶，边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞），超净工作台，倒置显微镜，CO2孵箱（孵育培养物），水浴锅，4℃冰箱（放置serum和培养用液）。）

1.培养器皿的清洗与消毒

玻璃器皿的清洗

一般经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后50℃烘干。

新的橡胶制品洗涤方法

0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，

0.5M HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，

蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

压力蒸汽消毒器：湿热消毒，15磅，维持20-30分钟。

消毒前常用的包装材料：牛皮纸、棉布、铝饭盒

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电热干燥箱：干热消毒，160℃～180℃，维

持2小时。主要用于玻璃器皿消毒。

3.培养用液有哪些水、平衡盐溶液（PBS、D-Hank,s液）、碳酸氢钠液、HEPES缓冲液、胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液、抗生素溶液、天然培养基（血清、血浆、组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液））和合成培养基（包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物；目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM）

4.如何进行细胞计数，注意什么，细胞计数法：就是从需要计数的细胞悬液中取出一定量细胞进行计数，并通过计数得知原始细胞悬液中的细胞密度以及细胞总和数。在细胞计数时，若细胞浓度太高，可进行必要的稀释。血球计数板每一大方格长为1mm ，宽为1mm ，高为0.1mm ，体积为0.1mm3，可容纳的溶液是0.1μl ，那么每ml 溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的1000 0 倍。实验步骤（一）准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干。（二）制备细胞悬液：用胰蛋白酶消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104 /ml ，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm ，2min ），重悬浮于少量培养液中。（三）加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样。（四）计数：在显微镜下，用10 ×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。（五）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。细胞数/ 毫升原液= （4 大格细胞数之和/4 ）×104×稀释倍数）注意事项（一）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液，否则会影响细胞计数结果。（二）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，特别应该注意这一点，否则前后计数结果会有很大误差。（三）镜下计数时，遇到2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10% 以上，说明消化不充分；或细胞数少于200 个/10mm2或多于500 个/10mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。