达托霉素高产菌种和生产工艺技术
达托霉素(Daptomycin)高产菌种和生产工艺
达托霉素（Daptomycin，Cubicin）是自链霉菌(S.reseosporus)发酵液中提取得到的一个环酯肽类物质，它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同：本品能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰阳性菌。本品除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已呈甲氧西林（Methicillin）、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具强力活性。
本品现被批准用于治疗下列革兰阳性体外敏感菌所致并发性皮肤及皮肤结构感染：包括耐甲氧西林菌在内的金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌亚种似马链球菌和对万古霉素敏感粪肠球菌。
达托霉素具有可以赋予其临床优势的数项独特性质。首先，它的作用机制与现已上市的各类抗菌药物都不相同，这意味着达托霉素将不会受到来自其它抗生素所致交叉耐药性的影响。其次，达托霉素已经显现能在体外迅速抑制大多数临床重要革兰阳性球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素粪肠球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌。而此对其用于危重感染患者具有非常重要的临床意义。第三，与传统抗生素至少一日2次给药相比，达托霉素仅需一日1次用药，剂量方案明显简化并可有效降低医疗成本支出。最后，达托霉素似也存在更优的不良反应表现，这使它能够用于治疗不能耐受其它抗生素治疗患者。
达托霉素的产品规格：
（1）外观、色泽 白色结晶粉末
（2）含量（纯度）（HPLC）： 98.5 ≥%
（3）β-异构体 0.1 ≤%
（4）内酯物 0.1 ≤%
（5）脱水物 0.1 ≤%
（6）含水量 0.1≤%
（7）单一杂质 0.1≤%
（8）总有关杂质 0.5≤%
（9）残留溶剂 10≤ppm
（10）重金属 10 ≤ppm
（11）炽灼残渣 0.3 ≤%
达托霉素的工艺技术：
发酵水平：1.7-2.0g/L
发酵时间：260-270小时
收率：〉50%
生产菌：Streptomyces roseosporus
技术水平：中试以上
响应面法优化达托霉素发酵培养基
响应面法优化达托霉素发酵培养基
何美儒;金志华;胡升;张丽靖
【期刊名称】《化工进展》
【年(卷),期】2012(031)004
【摘 要】采用响应面法对玫瑰孢链霉菌发酵产达托霉素的培养基进行了优化。首先通过Placket-Burman设计法筛选出影响达托霉素产量的4个重要因素：初始pH值、葡萄糖、L-天冬氨酸（L-Asp）、硫酸钾。其中初始pH值的影响极为显著（p〈0.01）,因此,对初始pH值进行了单因素试验,得到最优初始pH值为8.6。在此基础上对其余3个因素用最陡爬坡路径逼近最大响应区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得到最适培养基组成为：葡萄糖13.0 g/L、L-Asp
2.6 g/L、硫酸钾4.1 g/L。在此优化条件下,达托霉素产量达373.98 mg/L,与预测值（365.76 mg/L）非常接近,比优化前产量提高了2.25倍。%The fermentation
medium of daptomycin,produced by Streptomyces roseosporus,was
optimized by response surface methodology.It was found that initial
pH,glucose,L-Asp and K2SO4 affected the daptomycin production
significantly in Plackett–Burman experiment,but the affection of initial pH
was predominant（p0.01）.The initial pH was optimized by one-factor-at-a-time experiment and the optimal pH obtained was 8.6.Then through the
【CN110339342A】一种达托霉素的盐或含盐的组合物及其制备方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日
(21)申请号 201910259945.8
(22)申请日 2019.04.02
(66)本国优先权数据201810290201.8 2018.04.03 CN
(71)申请人 江苏恒瑞医药股份有限公司地址 222047 江苏省连云港市经济技术开发区昆仑山路7号
(72)发明人 王立坤 韩江彬 鞠明珠
(51)Int.Cl.A61K 38/12(2006.01)A61K 9/14(2006.01)A61K 9/19(2006.01)A61K 47/02(2006.01)A61K 47/26(2006.01)A61P 31/04(2006.01)
(54)发明名称一种达托霉素的盐或含盐的组合物及其制备方法(57)摘要本发明提供了一种达托霉素的盐或包含该盐的组合物及其制备方法。本发明涉及医药领域，具体涉及达托霉素金属盐及包含该盐的固体或粉末制剂及其制备方法，采用喷雾干燥的方法制备的达托霉素的盐或其盐的组合物相比于非盐形式其具有改善的化学稳定性，进而能够提高
其抗菌疗效。
权利要求书1页 说明书9页CN 110339342 A2019.10.18
CN 110339342
A1.一种达托霉素的盐或包含该盐的组合物，其中所述的达托霉素的盐是非晶体状或非
结晶性的。
2.权利要求1所述的达托霉素的盐或包含该盐的组合物，选自钙盐、镁盐、锌盐和锰盐
中的任意一种或多种。
3.权利要求1所述的达托霉素的盐或包含该盐的组合物，所述达托霉素的盐是达托霉
素的钙盐。
4.一种制备达托霉素的盐或包含该盐的组合物的方法，通过冷冻干燥或喷雾干燥包含
达托霉素、金属离子和溶剂的溶液制备。
5.权利要求4所述的方法，所述的金属离子是多价金属离子，优选二价金属离子或三价
金属离子，更优选锌离子、镁离子和钙离子，最优选钙离子。
6.权利要求5所述的方法，所述溶剂包含水。
达托霉素及其衍生物生物合成的研究进展
达托霉素及其衍生物生物合成的研究进展
万涛;齐海山;陈云琳;闻建平
【期刊名称】《化工进展》
【年(卷),期】2012(031)007
【摘 要】With continuous appearance of highly pathogenic bacteria which
are resistant to antibiotics,the need for new antibiotics becomes much
pressing in clinical medicine.As the first production of cyclo-lipotpeptied
antibiotics daptomycin has effective bactericidal effect to antibiotic
resistant bacteria.Because of its convenience in preparation and
treatment,as well as insignificant side effects,daptomycin is the perfect
replacement of vancomycin recognized as the last line of defense to
pathogen.On the basis of introducing physical and chemical
characteristics,antimicrobial activity and research achievement of synthetic
genetic cluster of daptomycin,this paper mainly summarizes research
situation of daptomycin and its derivatives.And the paper also presents
达托霉素菌种16SrRNA基因序列分析和遗传稳定性检验
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达托霉素菌种16SrRNA基因序列分析和遗传稳定性检验
作者：李爱锋
来源：《科学与财富》2019年第25期
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摘 要：近几年来，达托霉素需求量猛增，作为次级代谢产物，由于结构比较复杂，达托霉素的产量极低。通过各种方法选育达托霉素高产菌株，保证种子批的遗传稳定性，对于提高达托霉素生产质量和产量，降低生产成本具有重要意义。大量试验表明，达托霉素在培养与保存过程中，可能会因培养液、保存环境等产生变异，从而降低甚至失去其在临床医学上较高的应用价值，而研发性能稳定、耐药菌抑制效果更好的达托霉素，对达托霉素菌种进行培养与筛选，获得质量好的菌种，降低菌种遗传变异的机率，改良达托霉素的生产工艺和提升达托霉素的产量就必须要对达托霉素菌种的16SrRNA基因序列开展分析并对其遗传稳定性进行检测。立足笔者工作实际，本文致力于对恒瑞医药的原辅料达托霉素菌种实施检验，确定恒瑞医药提供的菌种的遗传稳定性，为达托霉素的生产工艺优化与产量提升提供支持。
关键词：达托霉素;16SrRNA基因序列;遗传稳定性 龙源期刊网
1.前言
临床医学中，耐万古霉素粪肠球菌、耐万古霉素金黄色耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等是目前在医院中传播速率较快，致死率较高的病原体，由于抗生素滥用问题越来越普遍，细菌耐药性不断增强，采用普通抗生素对这些细菌的灭杀作用效果甚微，一旦发生感染，患者病情难以控制，最终很有可能导致患者因感染加深而病情加深，甚至不治。达托霉素是一种新型环脂肽抗生素，主要用于治疗耐药革兰氏阳性菌造成的感染，能够快速杀死绝大多数的细菌，不易受到其他抗生素所产生的交叉耐药性的影响，市场前景一片广阔，被誉为制剂简单、对耐药菌抑制效果良好、毒素作用小抗生素之一。
2013年，达托霉素在美国上市，被批注能用于治疗皮肤结构感染与复杂皮肤感染，如皮肤溃疡和术后切口感染，以及革兰阳性菌引起的各种严重感染，其中就包括了对甲氧西林敏感的右侧心内膜炎，菌落获得性肺炎和VRE感染。其副作用较小，安全性颇高，被临床医学界誉为耐药菌感染的最后一道防线。
癸酸钠抗性菌株产达托霉素培养条件的响应面优化
第５２卷 第４期
２０１３年７月 厦门大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） ＶｏＩ．５２ ＮＯ．４
ＪｕＬ ２Ｏｌ３
癸酸钠抗性菌株产达托霉素培养条件的响应面优化
段 然，叶驰名，吴意殉 ，卢英华，敬科举
（厦门大学化学化工学院，福建厦门３６１００５）
摘要：为提高玫瑰孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）ＮＲＲＩ １１３７９产达托霉素的能力，在实验室已有研究基础上对 生产菌株进行癸酸钠抗性筛选，得到癸酸钠抗性株Ｄ１０００一ｓ３—２一Ｐ２０００，经验证其能够耐受高癸酸钠浓度．此外，使用因子 筛选和响应面设计对发酵培养基进行氨基酸、维生素、微量元素种类的筛选和优化，最终确定培养基组成为（ｇ／Ｌ）：酵母 提取物１１，（ＮＨ ） Ｆｅ（ＳＯ ）。・６Ｈ Ｏ ０．８６，葡萄糖１ｏ．７，糊精７２，糖蜜７．２，组氨酸１．７，天冬氨酸１．３，Ｌ一天冬酰胺０．７４， 硫辛酸０．００７ ９２，ＺｎＳＯ －７Ｈ Ｏ ０．５５．利用此培养基进行摇瓶和发酵罐分批发酵培养得到达托霉素产量分别为４２．３８和 ４１１ ｍｇ／Ｌ，分别是优化前的２．５２倍和１．４６倍． 关键词：达托霉素；抗性筛选；响应面设计；培养基优化
中图分类号：Ｑ ９３９ 文献标志码：Ａ 文章编号：０４３８ ０４７９（２０１３）０４—０５３１—０８
达托霉素（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｄｐｔ）是一种由１３个 氨
基酸组成的环状肽链并在其Ｎ一末端色氨酸连接直链 癸酸侧链而成的环脂肽类抗生素口］．Ｄｐｔ由于其独特
的杀菌机制是通过扰乱细胞膜对氨基酸的运转，阻碍
细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，破坏细菌的细胞膜，从
而使其内容物外泄而达到杀菌目的，因此细菌对Ｄｐｔ 很难产生耐药性．Ｄｐｔ能够杀死绝大多数临床革兰氏
阳性菌，特别适用于超级耐药菌的治疗，如耐甲氧西林
金葡菌（ＭＲＳＡ），耐万古霉素金葡菌（ＶＩＳＡ），耐青霉
癸酸钠抗性菌株产达托霉素培养条件的响应面优化 2
癸酸钠抗性菌株产达托霉素培养条件的响应面优化
段然;叶驰名;吴意珣;卢英华;敬科举
【摘 要】In order to improve the production of daptomycin by
Streptomyces roseosporus NRRL 11379,sodium caprate resistance
screening method was applied to obtain high sodium caprate resistance
strains based on original research.A mutant strain D1000-S3-2-P2000 was
achieved and had been proved to be with tolerance in high sodium
caprate concentraion.Besides,amino acids,trace elements and vitamins of
the medium were screened and further optimized by response surface
methodology (RSM).The compositions of the optimized medium were as
follows(g/L):yeast extract 11,(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.86,glucose
10.7,dextrin 72,molasses 7.2,histidine 1.7,aspartic acid 1.3,L-asparagine
0.74,lipoic acid 0.007 92,ZnSO4·7H2O 0.55.The daptomycin production of
42.38mg/L(flask) and 411 mg/L(2.5 L-batch) were achieved,which were 2.52
达托霉素
3
1.注射用达托霉素 (H20100107 Cubist Pharmaceuticals, Inc. 86979424000050)
2.注射用达托霉素 (国药准字J20100001 Cubist Pharmaceuticals, Inc. 86979424000029)
3.注射用达托霉素 (H20090781 Cubist Pharmaceuticals Inc. 86979424000036)
注册证号 H20090781
原注册证号
产品名称（中文） 注射用达托霉素
产品名称（英文） Daptomycin for Injection
商品名（中文） 克必信
商品名（英文） CUBICIN
剂型（中文） 注射剂
规格（中文） 0.5g
注册证号备注
包装规格（中文） 1瓶/盒
生产厂商（中文）
生产厂商（英文） Hospira Inc. 赫士睿
厂商地址（中文）
厂商地址（英文） 1776N.Centennial Drive McPherson, KS 67460
厂商国家（中文） 美国
厂商国家（英文） U.S.A.
分包装批准文号
发证日期 2009-09-02
有效期截止日 2014-09-01
分包装企业名称 AstraZeneca AB
分包装企业地址 SE-151 85 Sodertalje Sweden
注册证号 国药准字J20100001
原注册证号 H20090781
产品名称（中文） 注射用达托霉素
产品名称（英文） Daptomycin for Injection
商品名（中文） 克必信
商品名（英文） －－－－
剂型（中文） 注射剂
规格（中文） 0.5g
注册证号备注
包装规格（中文） 1瓶/盒 生产厂商（中文）
生产厂商（英文） Hospira Inc. 赫士睿
厂商地址（中文）
厂商地址（英文） 1776N.Centennial Drive McPherson, KS 67460，U.S.A.
达托霉素菌种选育研究
达托霉素菌种选育研究
达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到。它能杀死临床上分离的绝大多数革兰阳性菌，具有广阔的应用前景。本实验确定了玫瑰链霉菌紫外诱变的处理时间为45s，链霉素对其的最低抑制浓度为2.1 μg/mL。通过对筛选得到的链霉素抗性菌株进行初筛和复筛，获得了一株达托霉素高产菌株NO. 201，其效价达到7652μg/mL，较对照组提高了90%。稳定性验证表明，该高产菌株传代5次仍然稳定，为后续生产提供了可能。
标签：达托霉素，玫瑰链霉菌，链霉素
1前言
达托霉素是由玫瑰链霉菌经发酵提取得到的脂肽类抗生素[1]。达托霉素在临床上表现出广谱、药效快、给药小、副反应小等优点[2]。
本文以紫外线诱变达托霉素生产菌株孢子悬浮液，筛选链霉素抗性菌株，获得了达托霉素高产菌株，并对获得的高产菌株的遗传特性及稳定性进行考察。
2实验方法
2.1 菌种
原始菌株由新昌制药厂菌种保藏中心保藏，作为诱变育种的出发菌株。
2.2 培养方法
取1 mL浓度为106个/ mL的孢子悬浮液接种种子培养基（30 mL/250 mL 摇瓶），30°C 250 r/min培养24 h至对数生长期；取2 mL种子液接种发酵培养基 （50
mL/500 mL 摇瓶） 30°C 250 r/min培养120 h，检测单位。
2.3 达托霉素的检测
采用Agilent 1200高效液相色谱仪测定。采用峰面积计算含量。
2.4 菌种诱变及筛选
2.4.1 单孢子悬浮液的制备
冷冻孢子移种于斜面，培养成熟后用灭过菌的0.85%LiCl溶液（做助变剂）制成孢子悬浮液，再用无菌玻璃珠将孢子充分打散，滤纸过滤，即得单孢子悬浮液。
2.4.2 紫外诱变处理
用吸管吸取5 mL孢子悬浮液于无菌平板中，置功率为30W，波长253.7nm的紫外灯下30 cm处开盖振荡照射一定时间，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板。
2.4.3链霉素耐受性突变株的筛选
从发酵液中提取达托霉素的工艺优化
圈
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－－５４２５．２０１３．０７．０２３ ２０１３，ＶｏＩ．３０ Ｎｏ．７亿学与生物互程 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
从发酵液中提取达托霉素的工艺优化
常 亮．魏增辉，李敏娜，梁冬，仲伟潭
（微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心
华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北石家庄０５００１５）
摘要：通过对迭托霉素发酵液预处理、溶剂萃取、结晶、干燥得到达托霉素粗品。确定了以ｐＨ值６．５～７．５的缓 冲溶液作为浸提溶剂、加入５～８ ＢＶ丙酮进行冷藏结晶的优化提取工艺。该工艺简单、经济，适合工业化生产。 关键词：达托霉素；发酵液；萃取；结晶 ． 中图分类号：ＴＱ ４６５．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—５４２５（２０１３）０７－－００８６—０２
达托霉素是一种新型的环脂肽类抗菌素，具有独
特的抗菌机制。达托霉素由连接到一个环状１３一氨基
酸肽的Ｎ－末端色氨酸上的癸酰基侧链构成，其中肽环
或羧酸肽环是由氨基酸和非蛋白质源氨基酸通过酰胺 键或酯键构成的［１］。由于脂链和疏水性基团的存在，
达托霉素具有一定的脂溶性，容易与细菌磷脂层反应，
因而具有良好的抗菌效果。 达托霉素结构复杂，稳定性差，制备非常困难。国 外采用微生物发酵法，通过离子交换树脂以及疏水介
质提纯达托霉素瞳］，国内中科院上海有机化学研究所
采用固相合成方法首次化学合成达托霉素［３］，福建微
生物研究所通过化学半合成工艺路线开发达托霉
素Ｌ４］。上述工艺路线复杂、周期长、成本高、产量低，距
离产业化仍有一段距离。文献［２ 报道，达托霉素在
ｐＨ值较低情况下，可形成胶束状态。作者利用这一
特性，采用微生物发酵法生产达托霉素，将达托霉素富
集到菌丝体，对从发酵液中提取达托霉素粗品的工艺
条件进行了研究。
１ 实验
１．１试剂与仪器
达托霉素发酵液为华北制药集团新药研究开发有 限责任公司提供。
激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株
激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株
激光诱变玫瑰孢链霉菌结合链霉素抗性筛选法选育达托霉素高产菌株
将经过20 mW激光辐照20 min的达托霉素(Daptomycin)生产菌株一玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)D-38的孢子悬液倾注在含有1.9μg/mL链霉素的高氏一号培养平板上.通过链霉素抗性法筛选获得了10%正变率的突变株,其中突变株LC-54摇瓶发酵单位为81.2 mg/L,比出发菌株提高了39%.
作 者：卢文玉 闻建平 范晶华 曹博翔 孙冰 LU Wen-Yu WEN Jian-Ping FAN Jing-Hua CAO Bo-Xiang SUN Bing 作者单位：天津大学化工学院生物工程系,天津,300072 刊 名：微生物学通报 ISTIC PKU英文刊名：MICROBIOLOGY 年，卷(期)：2006 33(3) 分类号：Q93 关键词：玫瑰孢链霉菌 链霉素抗性 达托霉素 He-Ne激光