低温脂肪酶产生菌Trichosporon pullulans的脂肪酶基因克隆

肖 冬 （ 陕西核 工业 二一 一地质 大队分 析测 试 中心 ， 西 西安 ７ ０ ２ ） 陕 １ ０ ４
摘
要 ： 产低 温 脂肪 酶 菌株 ５１为材 料 ， 酶 法 和 Ｃ Ｂ 法分 别 提 取 基 因组 Ｄ 以 — 用 ＴＡ ＮＡ， 过 琼 脂糖 凝胶 电泳 检 测 亮 带 通
进 行 比较 ， 果表 明 用 Ｃ ＡＢ法提 取 的 过 １ Ｓ ｒ ＮＡ 基 因鉴 定 ， 以待 检 菌株 浓 该 ８ Ｄ 即 提 取 的 ＤＮＡ 为模 板 ， １ Ｓ 、 ８ Ｒ 为 引物 ， 行 Ｐ Ｒ 扩 增 ， １ Ｓｒ ＮＡ 的 保 守序 列 分析 ， 定 为 Ｔ ｉ ｏ ｐ ｒ ｎ ｕ ｌ — 以 ８Ｆ １Ｓ 进 Ｃ 由 ８ Ｒ 鉴 ｒｃ ｓ ｏ ｏ ｌ ｈ ｐ ｕ
压湿 热灭菌 或者溶 液 的成分单独 灭菌 。
（） １ １× ＴＥ ｂ ｆｅ ： ０ ｍ ｍｏ ｕ ｆｒ １ ｌ・Ｌ＿ ｉ－ Ｃ （ Ｈ １ ＴｒｓＨ １ ｐ
（） ５ 用等体 积酚 （ 省 略） 苯 酚 一氯 仿 （ 前 静 置 可 、 用 过夜 ） 氯 仿 依 次抽 提 ， 匀后 静 置 ， 心 （ ３０ ０ｒ・ 、 混 离 １ ０
ｍｍ ｏ ・Ｌ一 ＥＤＴＡ ＋ １ ０ ｍｍｏ ｌ ０ ｌ・Ｌ— Ｎａ Ｐ ２ Ｏ３ １ ５ ＋ ．
ｖ ｎ Ｃ ＡＢ，ｍｒｓｏ 其 它 试 剂 均 为 国产 分 析纯 。引 ｏ ；Ｔ ａ ｅｃ； 物 由上海 生工生物 工程技 术服 务有限公 司合 成 。
ｍｏ ・Ｌ １Ｎａ ｌ Ｃ ｌ － Ｃ ＋１ ＴＡＢ， Ｈ值 ８ ０ ｐ ．。
～４ ５℃ 梯 度 降低 ． 关键词 ： 酵母 ｝ 肪 醇 基 因 ； 隆 ； Ｃ 脂 克 Ｐ Ｒ扩 增 中图 分 类 号 ： ８ Ｑ ７ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ６ ２ ４ ５ ２ １ ） ６ ０ ７ －０ １ ７ —５ ２ （ ０ ２ ０ － ０ １ ６
脂 肪 酶 （ ｉａｅ Ｅ ３ １ １ ３ 是 分 解 脂 肪 的 酶 ， Ｌｐ ｓ ， Ｃ ． ． ． ） 在
ｍｉ＿ ， ｎ ， 上清 。 ｎ 。５ｍｉ） 取
值 ８ Ｏ ＋１ ． ） ０ｍｍｏ ・ Ｅ ＴＡ（ Ｈ 值 ８ ０ 。 ｌＬ Ｄ ｐ ． ）
（ ） ｉ ＨＣ ： ｍｏ ・Ｌ １Ｔ ｉ ２ Ｔｒ － ｌ１ ｌ － ｒ Ｓ ｓ用 ＨＣ 调 节 至适 ｌ
（ ） ｎ ． ～１Ｂ 的异丙 醇 常温沉 淀 １ｈ 然 后离 ６ ２ ６ Ｖ ｏ ，
海新 苗 医疗器械 制造有 限公 司 ； 电泳仪 。 北京 六一仪 器
制 造厂 。 １ ３ 培养基 及培养 条件 ．
（ ） 培 养 １ ２ｄ的 菌 液 ２ １取 ～ Ｏ ｍＬ于 １ ０ ００ ０ ｒ・
ｍｉ 离 心 １ ｎ 取 ５ ｎ ０ｍｉ， ０ｍｇ菌泥加 ５ ０ ０ Ｌ无 菌水 清 洗 ， 心 ， 沉淀 ， 离 取 加入 １ ０ ０ Ｌ ＴＥ反 复 冻融 ２ ３次 ， ～
ｐｕ ＮＡ Ｌ ｄ ｅ ｌｓＤ ａ ｄ ｒ、 １ｋ ＮＡ Ｌ ｄ ｅ 、 Ａ Ｔ ｑ酶 、 ｂＤ ａｄｒＬ ａ
・
Ｌ １ ｉ ＨＣ （ Ｈ值 ８ ０ １ ＿ ｓ Ｔｒ － ｌｐ ． ） ０ｍＬ，． ６ ６ｇ Ｏ ５ｍｏ ０ ０ ０ ；． ｌ
Ｌ １ ＥＤＴＡ ． ２ ０ １ ６ 。 ＿ １ ０ １ Ｌ， ． ８ １ ｇ １
亿 爹 与 生 物 Ｚ 程 ２１，ｏ２ Ｎ． ０２ Ｉ９ ｏ６ Ｖ ．
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅ ｇｉｅ ｒ ｇ ｅ ｓｒ ｏ ｎ ｎｅｉ ｎ
ｄ ｉ１． ９ ９ ｊｉ ｎ １ ７ —５ ２ ． ０ ２ ０ ． ２ ｏ：０ ３ ６ ／．ｓ ． ６ ２ ４ ５ ２ １ ． ６ ０ １ ｓ
低 温 脂肪 酶 产 生 菌 Ｔ ｉｈ ｓ ｏ ｏ ｕｌｌｎ ｒｃ ｏ ｐ ｒ ｎｐ ｌ ａ ｓ ｕ 的脂 肪 酶 基 因 克 隆
产 ， 用于 油脂 化 学转 化 中的脂 肪 酶相 对少 一些 。 而
分数 ） 灭菌甘 油充 分混合 后 ， －８ 置 ０℃存放 。
１ ２ 试 剂与 仪器 ． Ｄ ＮＡ 回 收 试 剂 盒 ， Ｉ Ｔ ＡＮＧ Ｎ Ｉ Ｅ Ｈ； ｂ Ｅ Ｂ ＯＴ Ｃ １ ｋ
脂 肪酶 可 以用 于 多 不饱 和 脂 肪酸 （ 亚 麻酸 ） 食 物 色 、 素（ 青素）典 型蓝干酪 的气味分子 （ 虾 、 甲基 酮 ） 水 和
目前 ， 肪 酶 已广 泛应 用 于 工 业 生 产 领 域 ， 年 脂 每 约 有 １ ０ 脂 肪 酶 应 用 于 约 １ ０亿 ｔ去 污 剂 的 生 ０ ０ｔ ３
１ 实验
１ １ 菌株 ．
菌 株 ５１ 酵母 Ｔ ｉ ｏｐ ｒｎｐ ｌ ｌｎ —（ ｒｃ ｓ ｏｏ ｕｌ ａ ｓ茁芽 丝 孢 ｈ ｕ 酵母属 ） 将新 鲜 的 ０ ５ｍＬ菌 液与 ０ ５ｍＬ４ （ 积 ， ． ． ０ 体
生产酶。 作 者 在 此 对 低 温 脂 肪 酶 产 生 菌 Ｔ ｉ ｏｐ ｒｎ ｒｃ ｓ ｏ ｏ ｈ
植 物 、 菌以及 古细 菌ｒ］ 真 ” 。工业 用脂 肪 酶 多来 源 于微 生物， 产脂 肪 酶 的菌 类 主要 有 黑 曲霉 菌 、 光 假 单 胞 荧
菌、 白地霉 无根 根霉 菌 、 霉 圆柱 假 丝 酵 母 菌 、 毛 巢子 须
收 稿 日期 ：Ｏ ２ ０ － ２ ２ｌ— ３ ７
作 者简 介 ： 肖冬 （９ ６ ， ， 西 吉 安 人 ， 理 工 程 师 ， 究方 向 ： 物 化 学 ， － ｉ ｃｌｒ１ １２ ＠ １ ３ｃ ｒ。 １８ 一） 女 江 助 研 生 Ｅｍａｌ ｏｏ４ ４ ２ ９ ６．ｏ ： ｎ
肖 冬 ： 温 脂肪 酶 产 生 菌 Ｔ ｉ ｏｐ ｒｎｐ ｌ ｌｎ 低 ｒｃ ｓ ｏｏ ｕｌ ａ ｓ的 脂 肪 酶 基 因 克 隆／ ０ ２年 囊 ６啊 ｈ ｕ ２１
心 （ ３０ ０ ｒ・ｍｉ ＿ ， ５ ｍｉ ） １ ０ ｎ 。１ ｎ 。
当的 ｐ 值 。 Ｈ
（ ） ｒ 饱 和 苯 酚 ： 酚 用 １ ０ｍｍｏ ・Ｌ Ｔ ｉ ３Ｔ ｉ ｓ 苯 ０ ｌ ｒ－ ｓ
蛋 白酶 Ｋ， 天为 时代 ；ＮＴＰ ｄ ｓ、 Ｔ ｑＤ ａ ＮＡ 聚 合酶 、０ １
×Ｌ ｂ ｆ ｒ６ ｏ ｄｎ ｕｆｒＴａ ａ ａ Ｔｒ 碱 ， ｏ Ａ ｕｆ 、 ×ｌａ ｉｇ ｂ ｆ ， ｋ Ｒ ； ｉ ｅ ｅ ｓ Ｎ —
・
（ ） ＮＡ提 取液 ：０ ８Ｄ １ ０ｍｍｏ ・ － Ｔｒ ＿ ｌ ０ ｌ Ｌ １ ｉ ＨＣ ＋１ ０ ｓ
脂肪 酶产 生菌 主要 来 自系统 分析 树 的 两大 分 支 ：
・
个是原 核 细胞细 菌 ， 一个 是 真 核 细 胞 ， 括动 物 、 另 包
着酶 学 研究 的 快 速 发 展 ， 生 物 脂 肪 酶 的 应 用 领 域 微 仍 将 不 断扩 展 ， 以 预 测 ， 肪 酶 将 成 为重 要 的工 业 可 脂
１ ３ １ 培养 基 ．． 高 氏 Ｉ号 液 体 培 养 基 ： ％ 可 溶 性 淀 粉 ， ． ％ ２ ０１
ＫＮＯ ，０ ０ ％ ３ ．５ Ｋ２ Ｏ４ ． ５ ＨＰ ，０ ０ ％ Ｎａ Ｉ ０ ０ Ｃ ， ．５ Ｍｇ Ｏ ７ Ｏ，． ０ ％ Ｆ Ｓ ・ Ｈ２ ｐ 值 ７ ２ Ｓ ４・ Ｈ２ ０ ０ １ ｅ Ｏ ７ Ｏ， Ｈ ． ～
３ Ｏ℃ 、 ３ ｍｉ 摇 床培养 ２ 。 １ ０ｒ・ ｎ ～３ｄ
１ ４ 缓 冲 溶 液 ． ・
水浴 １ ５ｈ 不 时混匀 ） ． （ 。
（ ） 心 （ ３０ ０ｒ ｍｉ＿ ， ｎ ， 上清 与上 两 ４离 １ ０ ・ ｎ 。５ｍｉ） 取 步 的 ＴＥ合 并 。
所 有溶 液均用 超纯 去 离 子水 配 制 ， 使用 前 经 过 高
立式 高速冷 冻离 心机 ， 沙湘仪 ； 长 台式高 速冷 冻离 心机 ， 江西 日博 工 贸有 限 公 司 ； Ｃ 仪 ， ｅｈ ｅ 司 ； ＰＲ Ｔ ｃｎ 公
制冰 机 ， 国格兰特 中 国制 冷设备制 造有 限公 司 ； 美 移液 枪， 上海之 信 仪器 有 限公 司 ； 净 台 ， 州 净 化 ； 超 苏 灭菌 锅， 上海三 申 医疗器 械 有 限公 司 ； 电热恒 温 培 养 箱 ， 上
果 香 料 （－ ４羟基 癸 酸 ） 的生 产 ； 还可 用作 甘 油酯 中 的酯 交换 替 代 品 （ 生 产 巧 克 力 中 可 可 脂 的 替 代 品 ） 可 如 ；
通 过脂 肪 酶 修 饰植 物 油 中 的三 酰 甘 油制 得 婴 儿食 品
动 植物 组织及 微生 物 中普遍存 在 ， １ ３ 自 ８ ４年兔胰 脂肪 酶 的活性 报 道至今 ， 关脂 肪 酶 的 研 究 已有 上 百年 的 有 历 史［ ， 肪酶 的 自然 底 物是 在 水 中微溶 的长链 三 酰 １脂 ］
ｌｎ ａ ｓ茁 芽丝 孢 酵母 属 ｉ 用 脂肪 酶 的 同 源基 因 片段 来 设 计 引 物 ， 利 以该 茵株 的 Ｄ ＮＡ 为模 板 ， 行 Ｐ Ｒ 筛 选 ， 隆 脂肪 酶 基 进 Ｃ 克 因 ； 对 模板 量 、 火温 度 两 个 重要 因素进 行 优 化 ， 步 确 定 最 佳 Ｐ Ｒ扩 增 条 件 为 ； 板 量 为 Ｄ 并 退 初 Ｃ 模 ＮＡ 原液 ， 火 温度 为 ５ 退 ５
（ ） ｌ ＿ Ｎａ ： ０ ８ｇ Ｎ Ａｅ・３ Ｏ， ９ ３ ｍｏ ・Ｌ 。 Ａｃ４ ． ａ Ｈ２ 加
水 ４ ０ｍＬ溶解 ， 冰醋酸 调 ｐ 值 ５ ２ 定 容 １ ０ｍＬ。 加 Ｈ ．， ０
１ Ｓ 方 法 ．
１５ １ 模 板 Ｄ ．． ＮＡ（ 因组 Ｄ 基 ＮＡ） 的提取
１ ５ １ １ ＣＴＡＢ法 ［ ］ ． ． ． ¨ ，
在一 ８ ０～ 一 ６ ℃ 冰 箱 中 放 置 Ｉ ｈ 以 上 ， 高 温 ５ 再
（０ １０℃） 水浴 １ｍｉ。 ｎ
（ ） 心 （ ３０ ０ ｒ・ｍｉ ＿ ， ｉ ） 取 出 ＴＥ， ２离 １ ０ ｎ 。５ｒ ｎ 后 ａ 沉