产低温脂肪酶非极端细菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究

恽丽红－，蔡宇杰１，金永生－，廖祥儒卜，张大兵２ （１．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４１２２；２．江苏汉邦科技有限公司，江苏淮安２２３００１）
摘要：目的：筛选产低温脂肪酶非极端细菌菌株，扩大脂肪酶的应用范围。方法：利用维多利亚蓝Ｂ平板显色法和摇瓶发酵 法，从土壤中筛选产脂肪酶菌株，通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定，并对该菌株的产酶发酵培养基进行了优
迄今为止，研究的低温脂肪酶都是由低温微生物分泌产
温度较低的区域，大都属于假单胞菌属（Ｐ‰ｎａｓ）和气单 生的№’８“…。这些微生物主要分布于南、北极以及大洋底部等
胞菌属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）；这类菌生长慢，最适产酶温度较低；尽管 已经克隆得到不少低温脂肪酶基因并表达成功…】，但低温脂 肪酶基因的异源性表达能力差，仍需在低温条件下表达，难以 实现利用基因工程菌进行大规模工业化生产。低温脂肪酶的 表达量低、难纯化及热稳定性差等问题大大限制了其在工业 化生产中的应用。因此，低温脂肪酶产生菌及高产菌株的选 育越来越受到重视，酶学结构与功能的研究¨２１也受到了关注。
ｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐｏｐｅｒ．Ｔｈｅ ｏｐｒｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（％）ＷａＳ ｓｔａｒｃｈ １，ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ １，ＮａＮＯ，０．０８，ＣａＱ２
ｏｉｌ ２
１．‰ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ＯＰ
ｏ蛔ｎａｌ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｕｐ ｔＯ ３０．２ Ｕ／ｍＬ ａｔ ｔｈｅ
复筛：将初筛挑出来的菌株接人复筛培养基中，在３０℃、 ２００ｒ／ｍｉｎ培养２ｄ，然后用Ｐ—ＮＰＢ法¨４ ３测定酶活性，将产酶能 力较好的菌株挑选出来供下一步实验。 １．２．２酶活的测定方法
脂肪酶活性的测定以Ｐ—ＮＰＢ为底物，参考Ｍａｒｇｅｓｉｎ Ｒｏｓａ 等人“引的测定方法并略作修改。反应体系的成分为０．Ｉｍｏｌ／Ｌ
化。结果：得到一株产低温脂肪酶非极端细菌菌株ｓｙｂｃ—ｌｉ一１，该菌株适宜产酶培养基（％）为淀粉ｌ、牛肉浸膏１、ＮａＮ０３ ０．０８、
ＣａＣｌ２ ０．０４、ＭｇＳＯ，０．０４、橄榄油２和ＯＰ １；初始ｐＨ ８、３００Ｃ、２００ｒ／ｍｉｎ培养７２ｈ，脂肪酶活力可高达到３０．２Ｕ／ｍＬ；所产脂肪酶粗酶最适
ｃｏｌｄ—ａｄａｐｔｅｄ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｌｉｐａｓｅｓ ｔｈｏｓｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｏｎｌｙ ３０％ｏｆ ｔｈｅ商孚商ａｃｔｉｖｉｔｙ ＷａＳ ｌｏｓｔ ｗｈｅｎ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ ７０℃ａｎｄ ｐＨ
８．５ ｆｏｒ ６０ ｍｉｎ．Ｃｋｍｄｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ａ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｎａｌｌｌｉｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｉｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｌｉｐａｓｅ ｂｅｌｏｎｇ
从无锡惠山采集土壤，经富集培养、筛选获得菌株。 １．１．２试剂
Ｐ—ＮＰＢ（对硝基苯丁酸酯）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，其它试剂 均为国药公司分析纯试剂。 １．１．３仪器
ＵＶ一１６００ＰＣ紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公 司）；冷冻高速离心机（日本日立公司）；旋转式恒温摇瓶柜（上 海苏坤实业有限公司）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子 仪器厂）。 １．１．４培养基（％）
５６
生物技术
续表
—坠——一尘！曼！型型
５４
２３．２２ ２，４一二叔丁基苯酚２。４一ｄｉ—ｔｅｒｔ ＢｕｔｙｌＩｌｈｅｎｄ
５５
２４．４９ 反橙花叔醇缸ａｍ—Ｎｅｍｌｉｄｄ
５６
２５．５０ ａ一柏木醇口一Ｃ。ｄｍｌ
５７
２７．００ 十六醇Ｈ“日ｄｔ髓砌
５８
２７．髓 壬基苯酚Ｎｅｎｙｌ ｐｈｅｎｄ
的
２８．０４
菌株于ＬＢ固体培养基活化２４ｈ后，接种与ＬＢ液体培养 基３０℃、２００ｒ／ｒａｉｎ培养１２ｈ制成种子液。转接于发酵培养基进 行摇瓶发酵，发酵条件为：温度３０℃，摇床转速２００ｒ／ｍｉｎ，装液 量为５％。
（１）碳源：分别以大豆粉、葡萄糖、甘油、糊精、乳糖、酵母 浸出汁、纤维素、玉米粉、淀粉、蔗糖、果糖及牛肉浸膏为碳源， 其他条件不变，测定脂肪酶活力。每组处理重复３次，结果取 平均值。
对壬基苯酚Ｐ Ｎｅｎｙｌ ｔＤＩｌｅｎ，ａ
６０
２９．６７
十五烷酸Ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｄｄ
６ｌ
３０．９４ ｌ一苄氧基萘ｌ一（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘ７）Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ
竺型型竺曼型堕
Ｃ¨ＨｎＯ ｃ１５｝ｋＯ
ＣｕＨ笛Ｏ Ｃ１６ＨＭＯ
Ｃｕ％０
Ｃ１５ＨＭＯ Ｃｕ Ｈ∞０２ Ｃ１７Ｈ－Ｏ
２００８年１８（４）
中图分类号：Ｑ９３；０５５６
文献标识码：Ａ
文章编号：１００４—３１１ｘ（２００８）０４一００５６—０４
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｒｕｄｅ Ｅｎｚｙｍｅ’Ｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ Ｃｏｌｄ——ａｃｔｉｖｅ Ｌｉｐａｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａｍ
作者研究室从非极端环境中成功分离得到了一株产低温 脂肪酶细菌，优化了其产酶发酵条件，并对酶的酶学性质进行 研究。在实验室摇瓶培养条件下，其酶活力可达到３０．２Ｕ／ｍＬ， 与目前已报道的低温脂肪酶相比，热稳定性好，在ｐＨ ８．５、 ７０℃条件下保温６０ｍｉｎ，酶活力损失３０％，开发应用前景理想。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１实验材料
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，贼２１４１２２； ＹＵＮ Ｌｉ—ｈｏｎ９１，ＣＡＩ Ｙｕ—ｉｉｅｌ，Ｊ［Ｎ Ｙｏｎｇ—ｓｈｅｎ９１，ｕＡ０ Ｘｉａｎｇ—ｎ．１‘’，ＺＨＡＮＧ Ｄａ—ｂｉｎｇｚ
（１．＂ｌｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｇｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｑ醪，Ｊｉｓｒｇｎａｎ ２．Ｊｉｍｇｓｕ Ｈａｎｂｏｎ Ｓｅｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｈｎａｉ’ａｎ ２２３００１，Ｃｈｉｎａ）
Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）缓冲液，１０ｍｍｏｌ／Ｌ对硝基苯丁酸酯和适量的
酶液。反应液于３０℃保温１５ｒａｉｎ后加入酶液，在４０５ｎｍ下测定 吸光值（￡＝１．８６×ｌｏ＇ｃｒｎ“×Ｍ“），每个样品重复３次，取平均 值。以ｌｍｉｎ内催化产生ｌｔａｎｏｌ对硝基酚所需的酶量为１个酶 活力单位（Ｕ）。 １．２．３产酶菌株发酵培养基的优化口４ｍ】
ｔｏ ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ｈｐａｓｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｂｏｖｅ ｉｍｐｈｅｄ ｇｏｏｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｈｃａｆｉｏｎ·
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Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ｌｉｐａｓｅ；ｓｃｒｅｅｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｙ
．－
，（２）氮源：分别以蛋白胨、酒石酸铵、硝酸铵、尿素、酵母浸 出汁、硝酸钠、豆粕及牛肉浸膏为氮源，其他条件不变，测定脂 肪酶活力。每组处理重复３次，结果取平均值。
（３）无机盐：分别加入ＫＨ２附、］ｍｌＳ０４、ＣｕＳ０４、ＦｅＳ０４、ＫＣｌ、 ＮａＮ０２、ＦｅＣｌ３、ＮａＯＨ、刖ｑ、№ＳＯ，、ＺｌｌＳ０４、ＣａＣｌ２、ＮａＱ、ＮａＮ０３、
脂肪酶（“ｐａｓｅ，Ｅｃ３．１．１．３，甘油酯水解酶）是一类重要的 工业用酶ｎ‘“，被广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、 洗涤剂、有机合成、医药等领域。近年来，低温脂肪酶一直是
脂肪酶酶学研究的热点。低温脂肪酶一般在低温（＜４０。Ｃ）下 具有较高的酶活，最适反应温度在３０℃左右，０℃时仍有一定
１．２方法
“
１．２．Ｉ菌种筛选 １．２．１．１初筛——平板显色法¨３Ｊ
初筛：将富集培养后分离得到的菌株接种到初筛培养基 上，３０ｑＣ培养４８ ｈ后，观察所长菌落周围有无蓝色水解圈，水 解圈直径愈大，表示该菌株产脂肪酶能力愈强，将其中水解圈
直径与菌落直径最大者挑出来进行复筛。 １．２．１．２复筛——摇瓶发酵法
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｕｏｎ ｏｆ ｐＨ ８，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０℃，ｓｈａｋｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ２００ｄ
ｍｉｎ，ａｎｄ ｔｉｍｅ ７２ ｈ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐａｓｅ ｗｅｒｅ ｐＨ ９．５ ａｎｄ ２０℃ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｕ．ｎｈｅｍａｏｒｅ，ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ
万方数据
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生物技术
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的催化活性【６’８ Ｊ。通常低温脂肪酶具有４个独特的特征：１）最 适反应温度较低；２）低温下，催化效率高；３）热稳定性差．在有 机溶剂中稳定好；４）大部分低温脂肪酶对含有Ｇ—Ｃ。。这一长 链的甘油酯有更好的催化效率旧Ｊ。目前工业应用的脂肪酶大 多是中温和高温脂肪酶¨ＪＪ，它们大多由微生物产生，几乎均 为胞外酶，产酶的最适温度多在３０℃以上，而且这些酶的最适 反应温度一般在４０℃左右或更高，在０℃附近普遍丧失活性。 低温脂肪酶因其具有低温下酶活力高、抗有机溶剂等特点，有 较强的理论研究价值，工业应用前景广阔。
收稿日期：２００８—０４—１７；修回日期：加０８～０５—０７ 作者简介：恽丽红（１９８４一）。女．江力：｝ｒ阴人，硕士生，从事微生物生物 化学ｔｊ分子生物学研究；＊通讯作者：廖祥儒（１９６４一），男，江西南康 入，教授，博士生导师．研究方向：酶工程与生物技术，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉａｎｘｉａｎ．
Ｓｒｕ＠１６３．ｄｎ。
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开发与应用
ＤＥＶＥＬｏＰＭＥＮＴ ＡＮＤ ＡＰＰＵＣＡＴｒ０Ｎ
产低温脂肪酶非极端细菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究
ｓｈａｋｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔ遗ｅｄ ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｆｉｓｆｉｃｓ．１ｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｈｐａｓｅ—ｐｔｅｄｕｅ—
０．０４，Ｍ觚０．１３４，ｏｌｉｖｅ ｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉＯｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ｌｉｐａｓｅ ｎａｍｅｄ ｓｙｂｃ—ｌｉ一１ ｗａｓ ｏｂ－
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ａ ｓｔｌ＇面ｒｌ ｏｆ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ｌｉｐａｓｅ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｎｔａＩｇｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐａｓｅ ｉｎ
ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ａ ｈｐａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＷａＳ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｂｌｕｅ Ｂ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｌａｓｋ—
（１）富集培养基：酵母膏０．３，葡萄糖１，蛋白胨０．５，琼脂
２。ｐＨ自然。 （２）初筛培养基：蛋白胨１，酵母膏０．３，氯化钠０．３，琼脂
２，坚果油５，维多利亚蓝Ｂ（１：５０００）５，表面活性剂（ＯＦ）１，ｐｎ ７．
５。
（３）复筛培养基：蛋白胨１，氯化钠１，酵母浸出汁０．５，坚果
油４，表面活性剂（ｏＰ）１，ｐＨ ７．２。
作用湿度２０℃，最适ｐＨ ９．５，Ｏ℃时仍能保持７０％的酶活性，属于低温酶；该酶与目前报道的低温脂肪酶相比，有较好的热稳定性，
粗酶在ｐＨ ８．５、７０气条件下保温６０ｍｉｎ，酶活力损失３０％。结论：该菌株为自然环境中筛选的非极端细菌，所产脂肪酶为低温脂肪
酶，在开发应用上有良好的前景。
关键词：低温脂肪酶；筛选；发酵条件；酶学性质