低温脂肪酶的分离纯化及酶学性质
脂肪酶的产生菌的分离生产及其运用
三、脂肪酶的分离纯化
酶的分离纯化书将酶从细胞中或其它酶原料中提取出来，再与杂 质分开，从而获得符合研究和使用要求的酶制品过程。主要内容包括 细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分 离，电泳分裂，萃取分离，浓缩，干燥和结晶等。酶的纯化策略的选 择首先要考虑的是其用途，在实验室研究和临床治疗中所使用的应为 高纯度的酶；而工业用途的酶对纯度的要求就不是很严格，但是一定 纯度的酶制剂不仅可以保证催化反应快速有效地进行，而且也降低了 反应的复杂性，增加了反应的可预测性。一次，脂肪酶的纯化研究具 有重要的意义。大部分微生物脂肪酶为胞外酶，发酵后通过离心或抽 滤出去菌体，得到的含酶上清液通过硫酸铵或有机溶剂萃取浓缩，出 去部分蛋白质和糖类，然后再用层析法进一步纯化。除了少部分基因 工程菌能够高效表达功能性脂肪酶，绝大部分野生型菌株都要联合两 种以上的层析方法纯化才能获得预期纯度的蛋白质。
实验
1．1试剂和仪器 固定化脂肪酶Novozym435(工业品)，标称活力约为10 固定化脂肪酶Novozym435(工业品)，标称活力约为10 000 PLU／g；菜籽油(毛油)；甲醇(分析纯)； PLU／ ；菜籽油(毛油)；甲醇(分析纯) 油酸甲酯(化学纯) 1102型气相色谱仪(氢火焰) CDMA色 油酸甲酯(化学纯)。1102型气相色谱仪(氢火焰)，CDMA色 谱工作站进行数据处理。 1．2实验方法 将一定量的脂肪酶在油酸甲酯中浸泡、过滤，用菜籽油淋洗 0．5 h后，再在菜籽油中浸泡、过滤；或 h后，再在菜籽油中浸泡、过滤；或 者将脂肪酶依次在菜籽油和油酸甲酯中浸泡、过滤，最后用 菜籽油淋洗0 菜籽油淋洗0．5 h。 h。 在具塞锥形瓶中加入一定量的脂肪酶、菜籽油和甲醇，置于 温度为30℃、振荡速率为150 r／min的 温度为30℃、振荡速率为150 r／min的 空气浴振荡器中进行反应，每间隔一定时间取样，静止，分 层，由气相色谱分析上层产品中甲酯含量。待 反应结束后，静置、冷却、分层，取上层溶液经蒸馏( 反应结束后，静置、冷却、分层，取上层溶液经蒸馏(回收甲 醇)、反复洗涤，得到黄色澄清透明的产品。
产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析
刘思远，申东晨，刘峥，等. 产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析[J]. 食品工业科技，2023，44（20）：116−125. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120159LIU Siyuan, SHEN Dongchen, LIU Zheng, et al. Identification of A Cold-active Lipase Producing Strain, Optimization of Fermentation Conditions and Analysis of Enzymatic Properties[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(20): 116−125. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022120159· 生物工程 ·产低温脂肪酶菌株鉴定、发酵条件优化及酶学性质分析刘思远，申东晨，刘 峥，鲁丽颖，徐 恒，董爱荣*（东北林业大学 林学院，黑龙江哈尔滨 150040）摘 要：为筛选高产低温脂肪酶的菌株，并对产酶条件进行优化，同时为脂肪酶的工业化开发提供生产资料。
从黑龙江省漠河县土壤样品中筛选出一株产低温脂肪酶菌株，通过形态学鉴定、生理生化实验及分子生物学鉴定，确定该菌株为普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica ）。
通过单因素实验，探究温度、pH 、装液量、接种量、碳源、氮源、金属离子、诱导剂等不同因素对菌株产酶的影响，通过Plackett-Burman 实验，爬坡试验及响应曲面设计，优化橄榄油、蛋白胨、装液量等因素的添加量。
结果表明：该菌株最优产酶条件为20 ℃、pH7.5、装液量42 mL 、接种量0.5%、20 g/L 麦芽糖、14 g/L 蛋白胨、0.5 g/L 的MgSO 4·7H 2O 及46 mL/L 橄榄油。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究
工业微生物
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ｄｏｉ：１０ ．３９６９桙ｊ ．ｉｓｓｎ ．１００１ － ６６７８ ．２０１１ ．０６ ．０１６
Ｖ ｏｌ ．４１ Ｎ ｏ ．６ Ｄ ｅｃ ．２０１１
低 温 脂 肪 酶 产 生 菌 的 筛 选 、产 酶 发 酵 及 粗 酶 性 质 研 究
脂肪酶（Ｌ ｉｐａｓｅ ，Ｅ Ｃ ３ ．１ ．１ ．３ ，甘油酯水解酶 ）又 称三酰基甘油酰基水解酶 。 它的出现最早可以追溯 到 １９０１ 年 ，Ｅ ｉｊｋｍ ａｎ Ｃ ．Ｕ ｂｅｒ 等人从粘质沙雷 （氏 ） 菌 ，铜绿假单胞菌中分别发现了脂肪酶 ，这也是目前 研究的最好的几株产脂肪酶菌株 。 对能够水解甘油 三酸酯的酶的研究已有三百多年的历史 ，对脂肪酶 水解和合成酯类物质的研究也有 ８０ 多年的历史［１］ 。 脂肪酶可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸 （其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油 、 甘油和游离脂肪酸） ，也能催化酯化反应 ——— 水解反 应的逆反应 。 目前 ，脂肪酶在食品 、轻纺 、皮革 、香 料 、化妆品 、洗涤剂 、有机合成 、医药等众多领域［２ － ３］ 都有应用 ，是一类重要的工业用酶 。 脂肪酶中最适作用温度在 ３０ ℃ 左右而在 ０ ℃ 左右仍有一定催化效率的酶称为低温酶［４］ ，其特点 是低温下具有高催化活性 ，耐有机溶剂以及对热敏 感等［５］ 。 由于以上特点 ，低温脂肪酶在食品 、洗涤 、 制药 、脂类加工 、低温环境修复等方面有着巨大的应 用潜力 ，尤其是在环境修复方面 ，使用低温脂肪酶将 对保护环境产生非常积极的意义［６］ 。 碱性脂肪酶在 ｐＨ ８ ．０ ～ １０ ．５ 的范围内有高催
１ ．１ ．４ 培养基
产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究_图文_百度(精)
浙江大学硕士学位论文产低温蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶的提纯与特性研究姓名:刘静申请学位级别:硕士专业:微生物学指导教师:闵航20050501浙江大学硕士学位论文摘要本论文从土壤中分离筛选出一株产低温蛋白酶的菌株HL221,并进行了菌株鉴定、诱变提高酶活、发酵条件优化、粗酶的提纯和酶学特质的研究。
结果如下: 1.菌株的分离筛选及鉴定经过富集培养和分离纯化,获得了产低温蛋白酶的菌株HL221。
经形态学观察、生理生化特征研究及16S rDNA序列比对结果表明该菌属于金黄杆菌属(Chryseobacterium sp.菌株。
2.紫外线诱变提高酶活通过不同时间紫外照射进行菌种诱变,结果表明30s照射时间下,菌株产酶效果最佳,酶活由原出发菌株的110U/mL提高到230U/mL。
3.发酵条件优化通过单因子试验和正交试验,在摇瓶条件下对菌株的碳源、氮源、金属离子、培养温度、pH、接种量等产酶条件进行了优化。
得到了菌株的最适产酶条件(g.L’1为:葡萄糖30,蛋白胨15,Mn2+0.4,TweenS0O.1,K2HP047,KH2P04 3,培养温度25"C,培养基初始pH 7,接种量为20/0^-4%。
在此优化条件下酶活可达到305.9U/mL。
4.低温蛋白酶粗酶的提纯粗酶液通过硫酸铵沉淀、G.75和DEAE Sepharose F.F.柱层析从发酵液分离纯化得到纯酶,经过纯化后的蛋白酶比活力达到6076.9U/mg,提纯倍数为27.2, 得率为16.O%。
5.低温蛋白酶纯酶特性测得低温蛋白酶纯酶分子量为35000Da,等电点为4.9。
酶促反应最适温度 25。
C、最适pH为7。
酶活在低于25℃、pH7~lO范围内稳定,蛋白酶对酪蛋白的 Km为3.1meJmL。
关键词:低温蛋白酶;金黄杆菌:分离鉴定;紫外诱变;粗酶提纯:纯酶性质浙江大学硕士学位论文 Identification of Strain HL211Producing Cold-adapted Protease and Purification,Characterization of the proteaseLiuJing(College of Life Science,Zhejiang University,Hangzhou,China,310029 AbstractA strain of bacterium capable of producing cold—adapted protease was isolated and identified.The yield of cold—adapted protease was enhanced by UV treatment. The conditions for production of protease were optimized.The crude extract was purified andcharacterized。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
产低温脂肪酶假单胞菌的选育及产酶条件的优化_余琼
收稿日期： ２００５－ １１－ ０９ 基金项目： 浙江省重大科技攻关项目（ ２００４Ｃ１２０１０） 作者简介： 余 琼（ １９８１－ ） ， 女， 湖北赤壁人， ２００３ 级硕士研究生， （ 电话） ０２７－ ８７２８１２６７（ 电子信箱） ｆｉｓｉｎｇｆｙ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ； 通讯作者， 梁运祥。
第 ４５ 卷第 ５ 期 ２００６ 年 ９ 月
湖北农业科学 Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｖｏｌ． ４５ Ｎｏ．５ Ｓｅｐｔ．， ２００６
文章编号： ０４３９－ ８１１４（ ２００６） ０５－ ０６６２－ ０４
产低温脂肪酶假单胞菌的选育及产酶条件的优化
余 琼， 梁运祥 （ 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室， 武汉 ４３００７０）
Ｒ０．０１， 都说明回归模型拟合情况良好， 回归方程代表 性较好， 因此可以用该方程代替真实试验点对试验 结果进行分析和预测。另外从回归方程各项的分析 还得出 ， 方程的 一 次 项 、二 次 项 的 影 响 均 为 高 度 显 著， 说明各因子与响应值之间的关系不是简单的线 性关系， 而是二次关系。对上述回归方程求最大值， 解 得 各 因 素 的 取 值 为 ｘ１＝－ ０．８６， ｘ２＝－ ０．４５， ｘ３＝－ ０．３７， 相 当 于 橄 榄 油 为 ０．５７％， ２５０ ｍＬ 摇 瓶 装 液 量 为 ２１ ｍＬ， 摇瓶转速为 １８２ ｒ·ｍｉｎ－１。此时模型预测的最大 产酶量为 ８．０４６ Ｕ·ｍＬ－１， 在此条件下进行验证试验， 结果酶活力为 ７．８３３ Ｕ·ｍＬ－１， 可见该模型能够较好 的预测实际发酵情况。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＹＴ３４－ ８ 低 温脂肪酶发酵生产最佳培养基组成为： 玉米浆 ２％， 豆饼粉 ２．５％， 蔗糖 １％， 橄榄油 ０．５７％， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５％， Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％； 最佳发酵条件为： 发酵温度 ８℃， 初始 ｐＨ 值 ７， 发酵时间 ４８ ｈ， ２５０ ｍＬ 摇瓶装液 量 ２１ ｍＬ， 摇瓶转速 １８２ ｒ·ｍｉｎ－１。 ２．４ 菌 株 Ｐ ｓ ｅ ｕｄｏｍｏｎａ ｓ ｓ ｐ． ＹＴ３４ － ８ 产 脂 肪 酶 的酶学性质
酸碱耐受低温碱性脂肪酶产酶条件优化及其酶学性质
DOI:10.16498/ki.hnnykx.2018.011.001脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）又称三酰基甘油酰基水解酶（triacylglycerol acylhydrolases），属于α/β折叠酶家族，是一类能够催化天然油脂分解成脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯，并能在有机相中催化转酯、酯化、醇解等多种反应的酯键水解酶。
从其定义可知，有机溶剂耐受性是脂肪酶广泛应用的必备特性[1-2]。
一般来说，脂肪酶在有机相中进行催化反应具有诸多优点：酶的活性更高、稳定性更好、选择性更强，底物的溶解性更好，产物的回收更容易，底物/产物对酶的抑制程度更低，反应平衡更倾向于合成方向等[3]。
因此，脂肪酶在基于有机相催化的应用领域（如食品、精细化工、医药、生物能源等）具有较大潜力[4-5]。
低温碱性脂肪酶在温度10~35℃、pH值8.0~10.5的范围内具有较高的催化活力，较好的有机溶剂耐受性，较差的热稳定性，因此在低温碱性环境的工业领域（如洗涤剂、食品加工、毛纺加工、生物制药、低温环境修复等）应用广泛。
目前，低温碱性脂肪酶最大的应用领域是洗涤剂行业，其主要功能是清除衣物、碗碟、医疗器械上的油污以及疏通因油脂凝固而堵塞的下水管道[6]。
自从第一个有机溶剂耐受脂肪酶被鉴定以来，越来越多的有机溶剂耐受脂肪酶被人们发现，它们主要来源于假单胞菌属（Pseudomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）[7]。
然而，关于沙雷氏菌属（Serratia）脂肪酶具有有机溶剂耐受性的研究报道较少，到目前为止只有少数几个沙雷氏菌属脂肪酶表现出有机溶剂耐受性[8-13]。
笔者以实验室分离并保藏的沙雷氏菌 酸碱耐受低温碱性脂肪酶产酶条件优化及其酶学性质 陈 芳，石红璆，查代明，余甜甜，张炳火，李汉全 （九江学院药学与生命科学学院，江西九江 332000）摘 要：以沙雷氏菌JXJ-7为供试菌株，采用单因素试验确定了其最适发酵培养基配方、最佳胞外产酶条件，并对其粗酶酶学性质进行了研究。
黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究
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摘
要
黑曲霉 W$JJ 脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、 透析、 GN8N Q29?,/’<2 W,<: W(’@ 阴离子交换层析和 Q29?,62X UL%Y 凝胶
［!-］ 活性平板定性检测法参照 1<JK 的方法。除特殊 说明之外， 脂肪酶活性测定均采用滴定法。
储油厂油污土壤中分离筛选得到。结合菌落 （包括 菌丝体） 形态、 342+ 序列同源聚类分析和 567 序列 限制性内切酶 （ !"# ! ） 酶切电泳图等特征， 参照齐
［!#］ ［!&］ 祖同 和 +889:;< 等的方法鉴定并命名为黑曲霉
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生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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脂肪酶 （ :/4,30(;(032/’( ,30(?06/’(,<2，NI "Z#Z#Z"， 甘油三酰酯水解酶） 是一类能催化长链脂肪酸甘油 酯水解为甘油和长链脂肪酸 （或者是此反应的逆反
脂肪酶的分离纯化
贺州学院课程考核试卷（论文）（2013—2014学年第 1 学期）课程名称：酶工程开课单位：化生学院考核年级、专业：11生物工程任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法，对Candida sp. 99−125 脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200 U/mg，回收率为35.5%. SDS−PAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40℃，最适反应pH 值为8.5，在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH 和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油[4]、维生素A 酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此，本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candida sp. 99-125 脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2 材料与方法2.1 试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candida sp. 99−125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪；DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.2.2 实验方法2.2.1 粗酶液的制备取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.2.2.2 离子交换层析法纯化脂肪酶以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用0~0.4 mol/L的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15 倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3 疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中加入固体硫酸铵至0.8 mol/L，将该溶液注入经0.8 mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中. 先用0.8mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10 倍柱体积，最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析.2.2.4 脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法[7].酶活定义：脂肪酶在40℃, pH 为8.0 的条件下水解橄榄油乳化液产生1 μmol/min 脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位(记为1 U).2.2.5 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法[8]. 标准蛋白质为1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA).2.2.6 SDS−聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3 节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2 倍SDS−PAGE 上样缓冲液，经沸水浴加热3∼5 min，得到电泳样品. 电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150 V. 电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3 结果与讨论3.1 脂肪酶的纯化3.1.1 离子交换层析采用DEAE Sepharose FF (1 mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被DEAE 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质. 然后用NaCl 溶液梯度洗脱，结果如图1 所示.图1 层析柱DEAE 分离纯化脂肪酶图1 显示有2 个蛋白吸收峰(A, B)，A 峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A 峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B 峰为杂蛋白峰. 活性测定表明，A 峰的比活为16600 U/mg，纯化倍数为6.1 倍，酶收率为55.7%.但2 峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candida sp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2 疏水层析采用Phenyl Sepharose FF (1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被Phenyl 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，表明没有酶活性物质被洗脱出来. 用硫酸铵溶液梯度洗脱酶液的实验结果见图2.图2 表明，以梯度为0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵溶液洗脱时，脂肪酶蛋白并没有被洗脱下来，说明脂肪酶蛋白的疏水性比较强，与Phenyl 柱结合牢固；而以20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱时，洗脱液则表现出较高的脂肪酶活性. 脂肪酶经Phenyl Sepharose FF 层析柱进一步纯化后，收率为63.7%，纯化倍数为1.6 倍.图2 层析柱Phenyl 分离纯化脂肪酶综上所述，Candida sp. 99-125 脂肪酶在经过DEAE离子交换层析和Phenyl 疏水层析两步纯化后，其比活为27200 U/mg，比粗酶提高了10.0 倍，产品收率为35.5%.3.2 脂肪酶的性质3.2.1 脂肪酶的最适反应温度分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同温度下的酶活性，结果见图4，表明该脂肪酶的最适反应温度为40℃.3.2.2 脂肪酶的最适反应pH 值在37℃下，分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同pH下的酶活性，结果见图5，表明该脂肪酶的最适反应pH 值为8.5.3.2.3 脂肪酶的温度稳定性将纯化后的酶液在不同温度下放置1 h 后测定酶活性，结果见图6. 该脂肪酶在高于35℃的条件下容易失活，但在室温(20∼30℃)下放置时具有较好的稳定性. 将酶在室温(20℃)下放置2d，其酶活收率在95%以上.3.2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入5 mmol/L 的MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2 溶液和2.5 mmol/L 的K2SO4 溶液，在30℃下放置30 min，以不加离子的酶液为对照，分别测定其酶活.图7 表明，Fe2+和Cu2+对此酶有明显的抑制作用；而Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%. 这说明适量的Ca2+能够促进脂肪酶活性的提高，对酶分子的最佳活力构象起稳定作用. 因此，可选择CaCl2 作为活化剂以提高酶活性.3.2.5 表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入1 mmol/L 的EDTA, β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT)和SDS,以及0.1%的Triton-X100, Tween80, Span60 和Span85，在30℃下放置30 min 后测定酶活，以不加表面活性剂或抑制剂的酶液为对照，结果见图8. 可见加入0.1%的Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而1 mmol/L 的SDS 的引入对酶有抑制作用，EDTA 对酶活性的影响不大，说明该酶不是金属结合酶. 其他表面活性剂和抑制剂对酶活性的影响不大.3.3 假丝酵母系脂肪酶性质的比较Candida antarctica 脂肪酶B 的催化活性强，比活约为9 U/mg (Fluka 公司商品酶，62288 lipase B, Candidaantarctica，recombinant from Aspergillus oryzae)，温度稳定性好，立体选择性高[9]，特别是商品固定化产品Novozyme 435 在60∼80℃下仍保持较高的催化活性[10].Candida rugosa 脂肪酶包含5 个同工酶[11]，不同的同工酶对不同碳链脂肪酸的选择性差别较大，纯化的LipA 比活为750 U/mg[12]，最适反应温度在35∼40℃，最适反应pH 值为7∼8[11].Candida lipolytica 脂肪酶报道较多，姜延程等[13]对该酶采用DEAE−Cellulose DE-52 和DEAE−SephadexA-50 离子交换层析等步骤纯化，比活提高27.4 倍，达到169 U/mg，收率11%；徐岩等[1]采用盐析和透析的方法将比活提高2.69 倍，收率45%；张金红等[14]采用疏水层析法对其进行分离纯化，比活提高了10 倍以上. 但该酶的温度稳定性差，在30℃下存放24 h，酶活损失50%以上[13].4. 结论通过Candida sp. 99-125 脂肪酶的分离纯化及其酶学性质研究，得到如下结论：采用DEAE Sepharose FF 离子交换层析和PhenylSepharose FF (Low sub)疏水层析两步进行纯化，使Candida sp. 99-125 脂肪酶的比活显著提高，达到27200U/mg，为粗酶的10.0 倍，收率为35.5%. 经分析该酶的分子量约为38 kDa.(2)Candida sp. 99−125 脂肪酶纯化后的最适反应温度为40℃，最适反应pH 为8.5. 该脂肪酶在室温(20℃)条件下具有较好的稳定性，放置2 d，其酶活保留达95%以上. Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而Fe2+, Cu2+和SDS 对其有明显的抑制作用.参考文献：[1] 徐岩, 李建波, 王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究 [J].无锡轻工大学学报, 2001, 20(3): 257−260.[2] Bourg-Garros S, Razafindramboa N, Pavia A A. Large-scalePreparation of 3-Hexen-1-yl Acetate Using Candida antarctica Immobilized Lipase in Hexane [J]. Biotechnol. Bioeng., 1998, 59(4):498−500.[3] Maria S C, Jose V S G. Lipase-catalyzed Synthesis of Chiral Amides:A Systematic Study of the Variables that Control the Synthesis [J].Tetrahedron, 1998, 54: 2877−2892.[4] Deng L, Nie K L, Wang F, et al. Studies on Production of Biodiesel byEsterification of Fatty Acids by a Lipase Preparation from Candida sp.99-125 [J]. Chin. J. Chem. Eng., 2005, 13(4): 529−534.[5] Yin C H, Liu T, Tan T W. Synthesis of Vitamin A Esters byImmobilized Candida sp. Lipase in Organic Media [J]. Chin. J. 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