11双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶
实验五 双水相萃取及分配系数的测定
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
酶工程4
组分（酶、溶剂、底物和产物）的а
• 最佳水活度与溶剂的极性几乎无关
w
是相同的。
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表征必需水作用的参数---热力学水活度
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获得恒定水活度的方法：
• 向反应体系中直接加水。 ×
• 用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。 • 直接向反应体系加入水合盐：Na2HPO4（二、七、十 二水合盐）
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3 专一性
枯草杆菌蛋白酶催化在水溶液中催化N-乙酰-L-丝氨酸乙酯和N-乙酰-L
苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应，在二氯甲烷或苯中：丝氨酸>苯丙氨
酸；在吡啶或季丁醇中：苯丙氨酸>丝氨酸 原因：溶剂改变底物分配系数
有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主 导反应。
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酶活性丧失的可能原因：
有机溶剂与底物或产物相互作用
• 直接作用：氯仿显著减少过氧化物酶催化苯酚的氧化，原因在于氯仿 是苯酚基的淬灭剂； • 影响底物或产物的分配
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2 活性
在反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性 （Super-activity）。 表面活性剂刚性壳层能缓冲酶结构波动性，保证酶结构的稳定； 保护酶避免与有机溶剂直接接触； 为酶催化反应提供巨大相界面，减小传质阻力
剂（如吡啶或二甲基甲酰胺） 例：在己烷中聚苯酚氧化酶的催化反应，极性的苯醌产物不溶于己烷，
导致在酶周围的水层发生不需要的聚合，该聚合物缠住酶，降低酶活，
《酬乐天扬州初逢席上见赠》带答案
酬乐天扬州初逢席上见赠刘禹锡1、本诗是古代酬赠诗中的佳品，其感情基调是由低沉愤懑到高昂乐观。
2、诗的第一联作者通过“凄凉地”和“弃置身”这些富有感情色彩的字句的渲染，表达出诗人被贬后的愤懑不平之情。
3、这首诗的首联写出了诗人怎样的遭遇？“凄凉地”、“二十三年”等词可以看出诗人远离京城，身处荒僻之地，长期被弃用的现实。
4、“怀旧空吟闻笛赋，到乡翻似烂柯人”一联抒发了作者怎样的思想感情？运用典故抒情，委婉含蓄地表达了作者对亲朋好友的无限思念和对物是人非的感慨。
5、诗的第二联中借用两个典故，表达了诗人怎样的思想感情？（1）闻笛赋：怀念故友。
（2）烂柯人：对岁月流逝、人事变迁的感叹。
6、①描述“沉舟侧畔千帆过，病树前头万木春”一句所展现的画面。
并说说该诗句揭示的自然规律（蕴含的生活哲理）？大江之上，沉舟之侧，千帆竞发；自然中，枯树前头，万木争春，一片春色。
这两句诗作者借用自然景物的变化蕴含着深刻的哲理，暗示社会总是向前发展的，新事物必将战胜旧事物，，未来肯定会比现在好，揭示了新陈代谢的自然规律。
②“沉舟侧畔千帆过，病树前头万木春”历来受到人们的赞赏，你怎样理解这两句诗？（1）大江之上，沉舟之侧，千帆竞发；自然中，枯树前头，万木争春，一片春色。
“沉舟”“病树”是诗人自喻，包含感慨身世，惆怅忧伤之情，但他对未来并不失望，坚信“沉舟侧畔”必然有千帆竞发，“病树前头”终究会万木争春，表现出诗人虽身经危难，但仍保持坚定意志的积极乐观、豁达豪迈的胸襟。
（2）这两句诗作者借用自然景物的变化蕴含着深刻的哲理，暗示社会总是向前发展的，新事物必将战胜旧事物，，未来肯定会比现在好，揭示了新陈代谢的自然规律。
③请任选一个角度赏析“沉舟侧畔千帆过，病树前头万木春”一联。
（1）大江之上，沉舟之侧，千帆竞发；自然中，枯树前头，万木争春，一片春色。
“沉舟”“病树”是诗人自喻，包含感慨身世，惆怅忧伤之情，但他对未来并不失望，坚信“沉舟侧畔”必然有千帆竞发，“病树前头”终究会万木争春，表现出诗人虽身经危难，但仍保持坚定意志的积极乐观、豁达豪迈的胸襟。
双水相萃取丽江山慈菇中的秋水仙碱
双水相萃取丽江山慈菇中的秋水仙碱石瑶;杨亚玲;李晚谊;刘谋盛【摘要】建立了由聚乙二醇( PEG6000)与(NH4)2SO4形成的双水相体系萃取丽江山慈菇中秋水仙碱的新方法.考察了PEG分子量、PEG的浓度、(NH4)2SO4的浓度和pH值对双水相成相及秋水仙碱萃取率的影响,并结合HPLC对萃取相进行检测.结果表明:PEG6000质量分数为8％,(NH4)2SO4质量分数为20％,pH为7.0时,双水相体系对丽江山慈菇粗提液中秋水仙碱萃取率达82.09％,富集倍数为6.84倍.此方法可用于丽江山慈菇中秋水仙碱的初步分离富集,且操作简单,绿色无污染.%A new method to extract the colchicine of Iphigenia indica in aqueous two-phase system(ATPS) formed by macromolecular compound PEG6000 and (NH4 )2SO4 was investigated. The effect of the molecular weight of PEG, the concentration of PEG, the concentration of (NH4) 2SO4 and pH on phase behavior of the ATPS and extraction efficiencies of colchicines was investigated systematically. Determination the content of colchincine in the extraction phase combined with HPLC. The results showed that the best ATPS was composed of 8% PEG6000 and 20% (NH4)2SO4 ,pH 7.0. The extraction efficiency of colchicine of crude extract could reach to 82.09% ,fold enrichment reach to 6. 84. This method could be used to initial separate and enrichment the colchicine of Iphigenia indica, simple operation and friendly to the environment.【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2012(024)010【总页数】5页(P1412-1416)【关键词】丽江山慈菇;秋水仙碱;双水相体系;HPLC【作者】石瑶;杨亚玲;李晚谊;刘谋盛【作者单位】昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明650500;云南省农业科学院药用植物研究所,昆明650223;昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明650500;云南省农业科学院药用植物研究所,昆明650223;昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明650500【正文语种】中文【中图分类】R284.2秋水仙碱是由百合科植物秋水仙中发现的一种重要的卓酚酮类生物碱，对细胞有丝分裂有明显抑制作用，在临床中主要作为抗癌药物使用，此外，对急性痛风性关节炎有特异治疗作用，作为抗痛风药使用。
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
微生物发酵产物的分离纯化
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术
（一）发酵液的预处理和固液分离 目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核 酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和 改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 方法：高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去 除，发酵液的凝聚和絮凝。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
酶的分离技术及进展
酶的分离纯化技术及进展摘要：随着工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题，本文介绍了沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等常规方法和反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等新型技术在分离纯化酶的应用。
此外，随着对工业用酶要求的提高，常规方法和新颖方法的结合也为分离纯化酶提供了高效的分离纯化效果。
关键词：酶分离技术生物分离一.引言酶作为生物催化剂，因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等催化特点,在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领域有着广泛的应用[1]。
大多数工业用酶都由微生物发酵得到，且随着发酵技术的优化已能成功进行大规模生产。
随着蛋白类临床治疗药物和工业用酶的广泛应用对大规模纯化酶的需求日益增加，酶制品的大规模分离纯化成为当前生物工程中的关键技术问题。
酶的分离纯化是指将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开而获得与使用目的要求相一致的有一定纯度的酶产品的过程。
常规的微生物酶分离纯化方法有沉淀法、离子交换、凝胶过滤、疏水相互作用色谱及亲和色谱等，新兴的分离技术，如反胶团萃取、膜分离技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等在分离纯化酶的应用上也取得了一定进展。
此外，利用常规方法和新颖方法相结合的分离技术为分离纯化酶提供了新的方法。
二.分离纯化酶的常规方法纯化方法的选择很大程度上取决于它在整个纯化方案中的位置和次序，为了获得最大纯化倍数和回收率，工艺次序及分离次序的选择也至关重要。
一般的分离次序遵循以下原则：将含量较多的杂质用尽量简单且经济的方法先分离出去，如沉淀、过滤和吸附；将费时又昂贵的工艺放在最后阶段。
因此在分离纯化酶之前通常需要对发酵液进行预处理，对于胞外酶，发酵液经离心或过滤除掉细胞,上清液用超滤、硫酸铵沉淀或有机溶剂抽提等方法浓缩；胞内酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用硫酸铵沉淀的浓缩方法。
双水相萃取技术
中草药成分等) 在双水相体系中服从Nernst分配定律:
K = Ct / Cb
其中ct 、cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度。
系统固定时,分配系数为一常数,与溶质的浓度无关。 当目标物质进入双水相体系后,在上相和下相间进行选择 性分配,这种分配关系与常规的萃取分配关系相比,表现出
长素等大分子生物物质的分离与纯化,取得了较好的成效。
近年来,双水相萃取技术的分离对象进一步扩大,已包括了 抗生素、多肽和氨基酸、重金属离子和植物有效成分中的
小分子物质。下表为近年来双水相萃取技术在生物物质分
离的部分应用实例。双水相萃取技术在生物工程分离中已 经显示了良好的应用前景。
EOPO为环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的随机共聚物
表面电荷 当盐的正、负离子对上、下两相有不同的亲和力， 即正负离子的分配系数不同时，就会在相间产生电位， 此电位差的大小为：
U2－ U1=[RT㏑(KB
Z-
÷ KA
Z+
)]/[F(Z+－Z-)]
、 KA
Z+分别表示
其中， U1、U2分别表示相1和相2的电位；Z+、Z-分 别表示一种盐的正、负离子价； KB
一般可获得较大的分配系数，也可调节被分离组分
在两相中的分配系数， 使目标产物有较高的收率；
⑶ 传质速率快,分相时间短。双水相体系中两相的含水 量一般都在80%左右，界面张力远低于水-有机溶剂 两相体系，故传质过程和平衡过程快速； ⑷ 操作条件温和，所需设备简单。整个操作过程在室 温下进行，相分离过程非常温和，分相时间短。大
双水相萃取技术在生物活性物质分离中的应用
双水相萃取技术在生物活性物质分离中的应用(华东理工大学化学与分子工程学院,上海200237)摘要：双水相萃取技术作为一种不破坏生物活性的分离手段，一直受到广泛的关注。
本文中，综述了近年来抗生素、酶、蛋白质等生物活性物质的的的双水相萃取方法。
关键词：双水相萃取，生物活性物质The Application of Aqueous Two-Phase Extraction in the Segregation of Bioactive Substance（School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Scienceand Technology, Shanghai 200237）Abstract:As the separation method does not destroy the biological activity of aqueous two-phaseextraction technology has been subject to widespread concern. This article reviews therecent years, antibiotics, enzymes, proteins and other bioactive substances in theaqueous two-phase extraction method.Keywords: aqueous two-phase extraction, bioactive substance1引言某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（Aqueous Two-Phase System,ATPS）。
利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，在1956年, 瑞典的Albertsson首次开发了双水相萃取法（Aqueous Two-Phase Extraction）来提取生物物质，自此对于双水相体系的研究和应用逐步展开, 并取得了一系列研究成果。
酵母分离纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握酵母菌分离纯化的基本原理和方法。
2. 学习使用显微镜观察酵母菌的形态特征。
3. 熟悉微生物实验室的基本操作技能。
二、实验原理酵母菌是一种单细胞真菌，广泛分布于自然界。
本实验采用稀释涂布平板法从混合样品中分离纯化酵母菌。
该方法基于菌落形成的原理，通过稀释样品，使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 酵母菌混合样品- 营养琼脂培养基- 无菌水- 灭菌器械（接种环、酒精灯等）- 显微镜2. 实验仪器：- 研钵- 玻璃棒- 离心机- 培养箱四、实验步骤1. 制备平板：- 将营养琼脂培养基加热融化，冷却至约50℃。
- 将融化后的培养基倒入培养皿中，待凝固后备用。
2. 样品稀释：- 将酵母菌混合样品用无菌水进行10倍稀释，制成不同浓度的稀释液。
3. 涂布平板：- 用无菌吸管吸取适量稀释液，滴加到平板中央。
- 用无菌玻璃棒轻轻涂抹，使样品均匀分布在平板表面。
4. 培养：- 将平板倒置，放入培养箱中培养。
5. 挑取菌落：- 在适宜的温度下培养，观察菌落生长情况。
- 根据菌落特征（如大小、形状、颜色等）挑取单菌落。
6. 纯化：- 将挑取的单菌落接种到新的平板上，重复培养和挑取过程，直至获得纯化后的酵母菌。
7. 观察与鉴定：- 将纯化后的酵母菌制片，用显微镜观察其形态特征。
- 根据酵母菌的形态特征（如细胞大小、形态、芽殖方式等）进行鉴定。
五、实验结果与分析1. 菌落观察：- 经过培养，平板上形成了不同形状、大小的菌落。
- 通过挑取和纯化，获得了纯化后的酵母菌。
2. 显微镜观察：- 在显微镜下观察，纯化后的酵母菌呈现为球形或椭圆形的单细胞结构，直径约为5-10微米。
3. 鉴定：- 根据酵母菌的形态特征，初步鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
六、实验讨论1. 本实验采用稀释涂布平板法成功分离纯化了酵母菌，该方法简单易行，适用于实验室常规操作。
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第37卷第5期2009年5月 化 学 工 程CHE M I CAL E NGI N EER I N G (CH I N A ) Vol .37No .5May 2009作者简介:杨建军(1973—),男,工程师,博士生,研究方向为生物催化与生物质转化,E 2mail:mysyjj@;马晓迅(1957—),男,教授,博士生导师,通讯联系人,电话:(029)88302633,E 2mail:maxy m@nwu .edu .cn 。
双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶杨建军,马晓迅(西北大学化工学院,陕西西安 710069)摘要:对南极假丝酵母脂肪酶(CAL )在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG )相对分子质量、NaCl 质量分数和(NH 4)2S O 4质量分数对分配系数K (C AL )的影响,结果表明:温度对K (C AL )影响不大;低相对分子质量PEG 与蛋白质的疏水作用可促进C AL 的分配;二相间电势差等对分配平衡、有较大影响。
在PEG2000/(NH 4)2S O 4双水相体系中,CAL 最佳的萃取分离条件为:室温下,质量分数20%PEG2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,此时,K (CAL )为8.16,C AL 回收率为91.2%。
关键词:脂肪酶;双水相;分离纯化中图分类号:Q 814.1 文献标识码:A 文章编号:100529954(2009)0520049204Separati on and puri fi cati on of Candida an ta rctica li pasei n aqueous two 2phase syste mYANG J i a n 2jun,M A X i a o 2xun(School of Che m ical Engineering,North west University,Xi ′an 710069,Shaanxi Pr ovince,China )Abstract:The partiti on behavi or of Candida an tarctica li pase (CAL )in aqueous t w o 2phase syste m (ATPS )was investigated .The effects of te mperature,relative molecular mass of polyethylene glycol (PEG ),the mass fracti onof NaCl and (NH 4)2S O 4on partiti on coefficient of CAL K (CAL )were studied .The results show that in ATPS,te mperature was uni m portant for partiti on coefficient of CAL K (CAL ),while the electric potential difference bet w een t op and bott om phase was i m portant .It was als o discovered that the less the molecule mass of PEG was,the more favorable conditi ons f or the CAL congregati on int o the phase because of the increased hydr ophobicity for med .A t the r oom te mperature,the op ti m ized extracti on conditi ons were as foll ows:mass fracti on 20%PEG 2000,12%(NH 4)2S O 4,1.5%NaCl,and K (CAL )was 8.16,the recovery rate of CAL was 91.2%.Key words:li pase;ATPS;purificati on 固定化脂肪酶催化酯交换反应生产生物柴油已成为近年来新能源研究的热点之一。
为了消除杂质的负面影响,提高固定化脂肪酶的催化效率,本文通过研究聚乙二醇(PEG )/硫铵双水相系统(ATPS )中脂肪酶的分离行为,介质条件变化对分离过程的影响,为生物柴油生产用脂肪酶的纯化提供技术条件。
1 材料与方法1.1 材料考马斯亮兰250,PEG1000,PEG2000,PEG 10000,牛血清蛋白,国药集团;PEG4000,PEG6000,天津科密欧。
1.2 方法1.2.1 蛋白质质量分数测定每一相中总的蛋白质质量分数在吸光度595n m 处采用B radf ord 法测定,以牛血清白蛋白为标准蛋白[1]。
1.2.2 脂肪酶活力测定脂肪酶活力测定按照QB /T180321993标准。
1.2.3 双水相体系制备在PEG/硫铵双水相体系中,成相所需的PEG 质量分数较PEG/磷酸盐体系低,又由于硫铵的水化能较低,相同相对分子质量的PEG 成相所需硫铵的质量分数也较低[2]。
故选PEG/硫铵体系作为研究对象。
按照实验选定的条件,将质量分数50%的PEG 溶液与40%的硫铵溶液配成相应的双水相体系,再加入已经配好的脂肪酶溶液至10g 。
在旋涡混合器上混合5m in,室温下静置2h,用移液器分别转移上相和下相于离心管中离心,离心机转速为2000r/m in 。
用微量注射器吸取一定量的上相和下相,测定其中的脂肪酶活性及其质量分数,计算分配系数和回收率。
1.2.4 分配系数的确定(1)分配系数KK =ρt /ρb(1)式中:ρt 和ρb 分别为上相和下相中被分离蛋白质的平衡质量浓度。
(2)酶回收率y t (%)y t =R K /(1+R K )(2)式中:相比R =V t /V b ,V t 和V b 是上下相体积。
(3)热动力学方程的确定[3]焓变(ΔH)与蛋白质在ATPS 中的分配有关,可以通过Van ′t Hoff 公式计算,由2个不同温度T 1,T 2下的分配系数K 1,K 2得到ΔH =R lnK 1K 21T 1-1T 2(3)自由能变ΔG =-R T ln K (4)熵变ΔS =(ΔG -ΔH )/T(5)2 结果与讨论2.1 温度对CAL 分配的影响在20,30,40℃,分别对C AL 在二相中的分配情况进行研究,并根据有关的热力学方程对其ΔG,ΔH 和ΔS 进行计算。
结果如图1,ΔH 2ΔS 对点变化的线性关系与蛋白质疏水区周围水的有序损失有联系(PEG 的乙烯链和蛋白质的表面疏水区域一起暴露在溶剂中),表明在此过程中水起到了重要作用[4]。
图1 双水相中CAL 分配的熵2焓补偿图Fig .1 Entr op ic 2enthal p ic compensati on p l ot for CALpartiti on in ATPS 图1表明,体系在PEG1000—6000时得到了负熵变值,为放热过程,PEG10000时得到一个正熵变值,为吸热过程。
负熵变表明当蛋白质从下相转移到上相时,蛋白质2聚合物复杂物最终状态的有序形成。
正熵变说明在PEG10000与蛋白质之间有一个排斥力。
此正热动力学值可以被解释为:由于蛋白质域的位阻效应,PEG 和蛋白质域之间缺少相互作用。
由图1可知,温度变化不大时,ΔH可以近似看作一定值。
温度变化影响上下二相物理性质的变化,从而影响到了CAL 的分配系数,但总的来说,温度对分配系数的影响不是很大(如图2)。
在常温下操作,CAL 的活性收率依然较高,同时有利于相分离和节约能源开支,故选择在室温下进行下面的实验。
图2 温度对CAL 分配系数的影响Fig .2 Effect of te mperature on K (CAL )2.2 PEG 相对分子质量对CAL 分配平衡影响实验中,PEG 的质量分数均为17%,而(NH 4)2S O 4的质量分数均为10%,将CAL 在pH 值为7.5磷酸盐缓冲液中的相对活力定义为100%。
在硫铵盐富集相中,由于硫铵盐对CAL 的沉淀作用,CAL 活力得到了提高。
在上相中,对于PEG1000、PEG2000和PEG4000酶活力也有一个提高,但随着PEG 相对分子质量的增加,CAL 的活力有所下降。
这也证明了PEG 对酶具有修饰作用(通过与蛋白质的相互作用,修饰酶的活性位点,从而影响其活性)。
图3还表明了PEG 相对分子质量对于分配系数的影响。
随着PEG 相对分子质量增大,K (CAL )值增大,PEG6000和PEG10000却相反。
这是由于高质量分数的PEG 溶液渗透到CAL 的水化层使PEG 分子(具有部分疏水性)与蛋白质的疏水区进行相互作用的结果。
因此,PEG 对蛋白质的影响归于2个相对因子的平衡:一个是PEG 的排・05・化学工程 2009年第37卷第5期斥力,另一个是PEG 2蛋白质通过蛋白质暴露在溶剂中的疏水区黏合在一起,其主要依靠蛋白质的化学结构。
具有大面积疏水区的蛋白质在溶剂中与PEG 的相互作用应是驱使蛋白质在PEG 富集相中分离的唯一因素。
也有研究者[526]证实了PEG 是一个柔性分子,它能够通过分子间的疏水键获得一个紧密的稳定结构,此结构使其比完全伸展时与溶剂的相互作用更小,但与蛋白质的相互作用增强。
从图3中不难发现,无论从相对活力考虑还是从分配系数来看,应该选择PEG2000作为双水相体系中的上相组成物质。
图3 PEG 相对分子质量对CAL 分配系数及相对活力的影响Fig .3 Effect of PEG relative molecular mass on K (CAL )and CAL relative activity2.3 PEG/硫铵系统中硫铵质量分数对CAL 分配平衡影响分别在PEG 质量分数为14%,16%和18%时,研究硫铵质量分数对K (CAL )的影响情况。
结果如图4所示。
图4 PEG2000/硫铵系统中CAL 分配系数与硫铵质量分数的关系Fig .4 Relati onshi p bet w een K (CAL )and mass fracti on ofammonium sulfate in ATPS 随着PEG2000质量分数的增加,K (CAL )一直在增大,PEG2000与CAL 疏水区的相互作用逐渐增强。
只有二相的质量分数均达到一定值时,才会很容易地形成二相,并在上相中富集。