脂肪酶实验方案
脂肪酶活测定
一．脂肪酶活测定原理：脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。
在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。
水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。
酸碱滴定法 :酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。
脂肪酶活力单位＝(A-B)*nf/t*v式中：A为样品耗碱液ml数，B为对照组耗碱液ml数，n为每毫升碱液微克分子数(n=cM=0.05x23x1000)，f为稀释倍数，t为作用时间(分),v:反应的酶液的体积二．挥发性脂肪酸（VFA）的测定滴定法分析1原理：将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH 溶液滴定馏出液。
废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮。
4．计算挥发性脂肪酸含量计算如下：VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)式中：V(NaOH)-----滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml;c ------ 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;Vs--------被测废水水样的体积，ml.酶活力定义：40℃,ph为5.6的条件下，每分钟酶解淀粉释放出lmg的还原糖(葡萄糖)所需酶量为一个酶活力单位。
1U=1mg还原糖\min.ml酶三．淀粉水解酶活性原理：淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位体积样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
四.纤维素酶酶活力测定：原理：纤维素酶水解纤维素，产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定的范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。
脂肪酶
显色剂，均匀搅拌3min，油酸分子与Cu2+
生成绿色的络合物，4000r/min离心10min
后取上层有机相在710nm处测定吸光度。
（三）、对硝基苯酚法
1、溶液配制准备
底物溶液配制:量取对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)0.0378g，加入Triton X-100 1mL，用50mmoL/L Tris-HCL缓冲液（pH值8.0）定容100mmL。
8
9
10
10
20
14
38
33
五、结果与讨论
测定速度： 滴定法 稳定性： 铜皂法 铜皂法 对硝基苯酚法 对硝基苯酚法 滴定法
灵敏度：
对硝基苯酚法
铜皂法
滴定法
实际应用中，可根据不同需要选择测定方法。
酶相互间无法进行正常的活力比较。本实验就酸
碱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定法、铜皂法、对硝基苯酚法三种常用方法 进行了比较。
二、实验材料
脂肪酶，生物工程研究室提供
榨汁机，分析天平，碱性滴定管， 分光光度计，pH计，离心机，恒温水浴锅
脂肪酶活力单位
脂肪酶活力单位定义：在一定条件下，
每分钟释放出1μmoL脂肪酸的酶的量定义为
一个脂肪酶活力单位（U）。
三、实验方法
（一）、滴定法
底物溶液（乳化液）配制:量取4%PVA溶液150mL, 加入橄榄油50mL，用榨汁机处理3min，现配现用。
脂肪酶溶液配制:配制pH值为7.38的0.5mg/mL脂
肪酶溶液。
(二)、铜皂法
1、脂肪酸吸光度标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的油酸溶液，分别 取4mL油酸溶液置于锥形瓶中，加入1mL
18.32
16.98
19.23
脂肪酶实验方案
脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6.0 ,7.0 ,8. 0.种子培养基( %) :葡萄糖 2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0.1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。
观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。
脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按 1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。
脂肪酶测定标准操作程序
脂肪酶测定标准操作程序1. 摘要脂肪酶检测用于定量测定人血清或血浆中脂肪酶的活力，用于临床相关疾病的辅助诊断。
2. 适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中LPS 的浓度。
3. 职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定LPS 浓度的工作人员要严格按照本SOP 程序进行,室负责人监督管理；本SOP 的改动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4. 检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的二脂肪酶监测试剂盒采用的是酶法。
5. 原理1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯−−→−脂肪酶1，2-领-二月桂基-消旋-甘油+戊二酸+6-甲基试卤素灵 1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯在样本中的脂肪酶的作用下水解生成1，2-领-二月桂基-消旋-甘油、戊二酸以及红色的6-甲基试卤素灵。
由于甲基试卤素灵在波长570nm 附近处有吸收峰所以在一定脂肪酶活力范围内，570nm 处吸光度的变化值与样本中脂肪酶活力成正比。
6. 仪器日立7600自动生化分析仪7. 试剂7.1 试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2 试剂瓶内主要成分：R1：Good ’s 缓冲液、共脂肪酶、脱氧胆酸钠、乙酸钙R2：酒石酸缓冲液、1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯、牛脱氧胆酸钠。
7.3 试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
试剂开瓶后冷藏于分析仪中可以保存14天。
7.4 试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
脂肪酶的测定
脂肪酶的测定脂肪酶是一种能够加速脂肪分解的酶类物质，它在人类的体内起着非常重要的作用。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，可以用于研究肥胖、代谢疾病等疾病的发病机制。
脂肪酶的测定方法有很多种，其中最常用的是化学法和免疫法。
化学法是利用化学反应测定脂肪酶的活性，它的原理是将样品与一种特定底物反应，通过测定产生的底物或反应产物的浓度，来计算脂肪酶的活性。
常用的底物有三酰甘油、辅酶A等。
免疫法则是利用特异性抗体与脂肪酶结合反应，进行测定。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单等优点。
在进行脂肪酶测定前，需要收集样品。
常用的样品有血浆、血清、尿液等。
对于血浆和血清样品，需要在采集后立即离心分离血清或血浆，避免冷藏时间过长而影响测定结果。
对于尿液样品，需要在采集后立即保存在冰箱中，避免样品在室温下发生酶解反应。
此外，还需要注意样品的质量和数量，以保证测定结果的准确性。
脂肪酶的测定结果可以反映人体脂肪代谢能力的强弱。
正常情况下，脂肪酶的活性处于一定的范围内。
如果脂肪酶活性过高，说明人体脂肪代谢能力较强，有利于减肥和预防肥胖等疾病；反之，如果脂肪酶活性过低，说明人体脂肪代谢能力较弱，容易出现肥胖和代谢性疾病等问题。
需要注意的是，脂肪酶的测定结果并不是唯一的评估指标，还需要结合其他指标如体重、体脂率、血糖、血脂等指标进行综合分析。
此外，脂肪酶的测定结果也受到许多因素的影响，如年龄、性别、饮食、运动等因素都会对脂肪酶活性产生影响，因此需要综合考虑。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，它对于研究肥胖和代谢疾病等疾病的发病机制具有重要的意义。
在进行脂肪酶测定时，需要注意样品的采集、处理和测定方法的选择，以保证测定结果的准确性。
芽孢杆菌液体发酵产脂肪酶实验报告
芽孢杆菌液体发酵产脂肪酶实验报告一、引言脂肪酶（lipase）是一种能催化脂肪水解的酶，广泛存在于微生物中。
而芽孢杆菌（Bacillus）是一种常见的细菌，具有良好的产酶性能和酶稳定性。
本实验旨在通过芽孢杆菌的液体发酵过程，获得高效产脂肪酶的条件，并对其产酶能力进行评价。
二、材料与方法2.1 发酵菌种的培养与保存1.预先培养芽孢杆菌菌株。
2.将菌株保存在琼脂斜面培养基中，并置于4℃冰箱保存。
2.2 液体发酵过程1.准备适宜的发酵培养基。
2.将预培养菌株接种到发酵培养基中，初始菌液浓度为OD600=0.2。
3.在适宜的温度（如30℃）下进行培养，并设定一定的培养时间（如48小时）。
4.定时取样，测定菌液中脂肪酶的活性，并监测菌液的各项指标变化。
2.3 脂肪酶活性测定1.取培养液中适量的样品。
2.根据脂肪酶活性检测试剂盒的说明书进行实验操作。
3.记录结果并计算菌液中脂肪酶的活性。
三、结果与讨论3.1 菌液中脂肪酶的活性变化以下为菌液中脂肪酶活性的测定结果：培养时间（小时）脂肪酶活性（U/mL）12 5024 10036 15048 200通过对菌液中脂肪酶活性的监测，可以看出随着培养时间的延长，脂肪酶活性呈现逐渐增加的趋势。
在培养48小时时，菌液中脂肪酶活性达到最高峰，为200 U/mL。
3.2 脂肪酶产量的评价为评价菌株的产酶能力，计算菌液中单位体积的产酶能力，即单位体积菌液中的脂肪酶活性。
在本实验中，采用菌液中脂肪酶活性最高的时间点（48小时）进行单位体积产酶能力的计算。
假设培养液的体积为V mL，计算单位体积的脂肪酶活性为：200U/mL。
由此可见，在本实验中，芽孢杆菌液体发酵过程中，脂肪酶的产量为200 U/mL。
四、结论本实验通过芽孢杆菌的液体发酵过程，成功获得了高效产脂肪酶的菌株。
通过测定菌液中的脂肪酶活性，发现菌液中脂肪酶活性随着培养时间的延长呈逐渐增加的趋势，在培养48小时时达到最高峰。
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及方法脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。
2.所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma公司3.标准曲线绘制：a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b.标准曲线绘制：分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH 的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。
脂肪酶(LIP)测定标准操作程序SOP文件
4-8℃7天
-20℃1年
不能应用其他种类的抗凝剂，否则会造成结果的假性偏低，因为其他抗凝剂会造成lip的失活。
4试剂
4.1试剂
来源：ROCHE配套试剂（详见试剂说明书）。
贮存条件及稳定性：未打开试剂盒：2－8℃储存至效期末
R1：打开后机上稳定28天R2：Fra bibliotek开后机上稳定28天
准备：直接使用。
S.VOLUME(NORMAL) [ 3 ]
SD LIMIT [ 0.1 ]
S.VOLUME(DECREASE) [14/3/140]
SENSITIVITY LIMIT(LOW) [ 3.7 ]
S.VOLUME(INCREASE) [ 6 ]
SENSITIVITY LIMIT(HIGH) [ 6.5 ]
ABCD医院
生化实验室
文件编号：
ABCD-SOP-04-09
脂肪酶（LIP）测定
版序：ABCD
页码：第1页，共3页
1测定方法
速率法。
2测定原理
1,2-氧-dilauryl-消旋-甘油-3-戊二酸酯脂肪酶1,2-氧-dilauryl-消旋-甘油＋戊二酸酯戊二酸酯自发降解戊二酸＋methylresorufin
5仪器
ROCHE MODULAR P或日立7060生化分析仪。
6上机操作
见仪器作业指导书。
7参考范围
成年人：13-60/l
8性能指标
本法线性范围为3-303U/l，不准确度允许范围 ±10%，不精密度CV=0.65%，灵敏度为3U/l。
9注意事项
9.1血清标本出现溶血、脂血、黄疸或抗坏血酸的干扰情况参见抗干扰能力。
PROZONE LIMIT [ 0/LOWER ]
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脂肪酶实验方案
富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.
溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0.
3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0.
4 mL , pH 6. 0 ,7.0 ,8. 0.
种子培养基( %) :葡萄糖2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0. 1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.
发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然
产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。
观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。
脂肪酶高产菌株的筛选：
（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；
（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；
（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。
脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。
根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。
（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。
）
[A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。
B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。
测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。
在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。
1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。
]
(ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。
取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。
菌株产酶条件的优化
碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。
氮源对产酶的影响；以2 %糊精为碳源,分别选用蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵(均为3 %) 为氮源进行产酶实验。
起始pH 值对产酶的影响：1 mol/ L 的HCl 和1 mol/ L 的NaOH 调节发酵培养基的初始pH 值, 分别为4. 0 ,5. 0 ,6. 0 , 7. 0 ,8. 0 和9. 0 ,在30 ℃下发酵2 d ,测定酶活,考察初始pH 值对酶活的影响. 结果显示,初始pH对产酶的影响很大,该菌株产酶的最佳起始pH 值在7. 0 左右,当pH 在9 的时候,菌体几乎不生长,产酶下降
温度对产酶的影响：优化的培养基,在不同温度下(24 ,26 ,28 ,30 ℃) 摇瓶发酵培养,寻找最佳的发酵温度. 菌株060805 在28 ℃下产脂肪酶最多
不同Mg2 + 浓度对产酶的影响；变发酵培养基中Mg2 + 的浓度,观察不同浓度的Mg2 + 对产酶的影响
脂肪酶的酶学特性
温度：脂肪酶酶促反应受温度影响很大, 在一定范围内温度升高反应速率加快, 一般来讲酶促反应的Q10为1～2。
另一方面, 温度过高会使酶蛋白变性失活。
大多数显示脂肪酶最佳温度范围介于30℃～40℃。
（25～55 ℃范围内以5 ℃为梯度以分光光度法(下同) 测定酶活）PH：脂肪酶的活力受pH 影响很大, pH 的变化可影响酶活性中心部位活性基团的解离, 从而影响到酶与底物的结合或催化底物转变为产物。
经调查, 大多数脂肪酶最适pH 值6～9。
（取一定量的纯化酶液与等体积的pH5. 0～11. 0 的各种缓冲液混匀,置于4 ℃下存放24h 后检测酶活(以未处理的酶液作为对照) ）
热稳定性：取20 mL 酶液分别置于40 、50 、60 、70 ℃恒温水浴处理60 min , 每隔10min 取样测定残留酶活力(以未经处理的酶液作对照) .（一定量的纯化酶液分别置于不同温度下恒温处理30min(以未处理的酶液为对照) 分光光度法(下同) 检测其酶活）
影响脂肪酶活力的活性因子：肪酶活性的影响因子很多, 包括各种金属离子和有机化合物及表面活性剂等物质。
Ca2+和Mg2+、Na+、K+和Li+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+（取一定量的酶液分别与等体积10mmolPL 的各种金属离子及不同浓度的表面活性剂混匀,置于4 ℃下存放24h 后测定酶活(以未处理的酶液作为对照)）。