测定α淀粉酶活力的方法
α–淀粉酶活力测定[辅导]
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α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。
2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。
二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。
酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。
1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。
这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。
淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。
通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。
碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。
三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。
2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。
3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。
4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。
5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。
6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。
四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。
（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。
（3）应时间大约在10-15分钟。
可见分光光度法测定α-淀粉酶活力
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化 学 与 生 物 工 程 ２０２０,Vol．３７No．０３ www．
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张雪娇,田欢,刘春叶,等 ．可见分光光度法测定 α
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DNS法测定α淀粉酶活力的方法
生物学研究中关于糖测定中常用 的方法
菲林试剂滴定——还原糖，常量分析 DNS比色法——还原糖，微量分析 蒽酮比色法——总糖，微量分析
配制系列浓度稀释液的方法
线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的 （0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；
对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓 度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀 释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍 稀释（1、1/10、1/100、 1/1000……）；
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续 排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反 应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原 糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生 成量（如DNS法），从而计算出酶活力单 位。
计算公式：根据标准曲线计算。
3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 配制说明
21g 氢氧化钠（先加入溶解）；
182g 酒石酸钾钠（同上）；
6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加 热完全溶于上述溶液中；
5g 重蒸苯酚（冷却后加入）；
5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）；
完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越 长越稳定。
酶 活 力 测 定 步 骤 （ 流 程 ）
蒸馏水 （mL）
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量 （mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂 （mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定 需要稀释倍数
实验一 α-淀粉酶活力的测定
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果 单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果 直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
X
[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制； 第二步：标准色的配制； 第三步：样品的酶解反应； 第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL
③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材 料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一 下午3点。先交到课代表，由课代表汇 总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。
α-淀粉酶测定的操作规程
α-淀粉酶测定的操作规程1、用途：测定人血清中或尿液中α-淀粉酶的酶活浓度。
2、原理：α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶偶联，水解特异性底物4,6-亚乙基-4-硝基苯酚-α-庚糖，产生对-硝基苯酚，对-硝基苯酚生成速率与α-淀粉酶的活性成正比，在405nm波长下用速率法检测。
3、适用仪器：奥林巴斯AU480型全自动生化分析仪.4、样本要求：4.1、样本种类：新鲜无溶血血清或尿液。
4.2、样本采集：常规静脉采血约2ml，不抗凝。
置普通管中，或采用含有分离胶的真空采血管。
尿液保存时应将pH值调节至7.0。
4.3、样本干扰：对反映吸光度有干扰的样本，包括溶血和浑浊的样本都可能影响检测结果遇上述情况建议重新采集标本。
4.4、样本保存：血清样本2℃—8℃可稳定7天，-20℃可保存一个月，忌反复冻融。
尿液样本2℃—8℃可稳定10天.5、检测方法：5.1、试剂的准备：试剂开瓶即可使用。
5.2、检测步骤：2、动生化分析仪操作步骤：参数设置→试剂装载→校准→质控→样品加载→测定→结果审核→报告。
5.3、校准：用K因素进行试剂空白校准，也可使用Diazyme公司校准品进行校准操作，当试剂更换批号、出现质控漂移、仪器做完保养后及重要零件更换时，须重新校准。
5.4、结果计算：全自动生化分析仪会自动给出检测结果。
3、6、参考范围：(各医院应根据本地区实际情况建立自己的参考范围。
）7、注意事项：7.1、试剂具有一定的酸碱性，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。
7.2、使用后的器具应按照规定处理，扔入指定的垃圾箱内，不可随处乱扔，防止环境污染和二次使用。
7.3、由于运输过程产生渗液或漏夜的产品，或在运输贮存中没有按照说明书要求进行维护的试剂，不可使用。
7.4、试剂只用于体外诊断。
8、参考文献：中华人民共和国卫生部医政司，全国临床检验操作规程（第三版），东南大学出版社，2006。
王惠萱、李雪梅、王冈，临床检验操作手册，云南科技出版社，2008.陆永绥、李清华、张伟民主编，临床检验自动化仪器分析标准操作规程，浙江大学出版社，2006.。
α-淀粉酶测定标准操作程序
α－淀粉酶测定标准操作程序1.摘要α－淀粉酶试剂盒适用于定量测定人血清、肝素化血浆、尿液样本中α－淀粉酶的活力。
2.适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中α－AMY的浓度。
3.职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定α－AMY浓度的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司的α－AMY试剂测定采用CNPG3方法。
5.原理底物CNPG3在α－AMY催化下产生的 2－氯－4－硝基苯酚（CNP）引起波长405nm 处吸光度上升，上升的速率与α－淀粉酶的活力成正比。
5CNPG3−−→−AMY3CNP+2CNP2+3G3+2G6.仪器日立7600自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：MES缓冲液（PH6.0）、醋酸钙、硫氰酸钾、CNPG3。
表面活性剂、防腐剂7.3试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
试剂打开后冷藏于分析中可保存28天。
7.4试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
每日在测定前做一次质控。
该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。
8.3质控数据管理：按程序对检验后的质控后结果进行转换，及时质控数据进行分析处理，如出现失控值，应及时分析失控原因，并填写好相关失控记录。
8.4质控判断规则：按《Westgard多规则质控方法测定标准操作程序》8.5室间质评：分别参加某地区室间质评，对回报的室间质评结果按《室间质量评价程序》进行处理。
二硝基水杨酸淀粉酶
二硝基水杨酸淀粉酶
二硝基水杨酸（2,4-dinitrosalicylicacid，简称DNS）淀粉酶法是一种用于检测淀粉酶（也称为α-淀粉酶）活性的常见方法。
这种方法基于淀粉的降解产生还原糖，进而与DNS反应，形成有色产物，可以通过测定产物的吸光度来定量测定淀粉酶的活性。
这个方法的基本步骤如下：
1.淀粉的降解：
淀粉酶催化淀粉分解成较小的多糖分子，主要是麦芽糖。
2.DNS试剂的添加：
加入DNS试剂，DNS试剂中的二硝基水杨酸与还原糖反应，生成有色产物。
3.热处理：
将反应混合物进行热处理，使得产物进一步显色。
4.吸光度测定：
使用分光光度计测定混合物的吸光度，吸光度值与还原糖的浓度成正比，从而可以间接地测定淀粉酶的活性。
这个方法是一种常用的、相对简便的淀粉酶活性测定方法，广泛应用于食品工业、酿酒业、生物技术等领域。
由于其敏感性和可操作性，使得这个方法在实验室和工业生产中得到广泛应用。
酶活力测定讲解
2019/5/10
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２.试剂 ? Folin- 酚试剂见“蛋白质含量测定”。 ? 0.4mol/L 碳酸钠溶液。 ? 0.4mol/L 三氯乙酸溶液。 ? 缓冲溶液
①PH7.5 磷酸缓冲液，适用于中性蛋白酶。 ②pH3.0 乳酸缓冲液，适用于酸性蛋白酶。 ③pH10.5 硼酸缓冲溶液，适用于碱性蛋白酶。
取两个100ml三角瓶分别于空白瓶和样品瓶中各加底物溶液4ml和磷酸缓冲液5ml于空白瓶加入95乙醇15ml40水浴预热5min然后在两瓶中各加待测酶液1ml立即混匀计时40水浴中准确反应15min在样品瓶中立即补加95乙醇15ml终止反应取出于空白瓶和样品瓶中各加酚酞指示液005mollnaoh标准溶液滴定直至微红并保持30s不退为其终点记录消耗005mollnaoh标准溶液的体积201951035计算酶活力定义
上述各种缓冲溶液，均须用 pH计校正。
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10g/L 酪蛋白溶液：称取酪蛋白 1.000g ，准确至 0.001g ，用少量 0.5mol/L NaOH 溶液（若酸性 蛋白酶则用浓乳酸 2～3滴）湿润后，加入适量 的各种适宜 pH 的缓冲溶液约 80mL ，在沸水浴 中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入100mL 容量瓶中，用适宜的 pH 缓冲溶液稀 释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为 3d 。
１.原理 α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的
糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉 与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消 失，观察并测定颜色的消失速度可以衡 量酶活力的大小。
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２.试剂 原碘液：同“分光光度法”。 稀碘液：同“分光光度法”。
20g/L 可溶性淀粉溶液：同“分光光度法”
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实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响
一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。
二、实验原理
酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。
酶催化的反应称为酶促反应。
生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。
能提高酶活力的物质，称为激活剂。
激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。
使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。
氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。
应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。
酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。
同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。
食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。
但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。
α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。
三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
（一）试剂及材料
1、1：30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。
2、0.2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。
3、1%NaCl溶液称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL 。
4、1%CuSO4溶液称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。
5、标准稀碘液称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。
吸取2mL 上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
取试管3根，编号后按下表配置实验样液。
用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。
四、温度与PH值对α-液化淀粉酶活力的影响
（一）试剂与材料
1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g（预先在105℃烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。
2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液
（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。
（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。
3、供试酶液的制备称取固体α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓
冲溶液100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成)，于40℃恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。
4、标准比色液
甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g，溶解并定容至500mL。
乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。
使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。
混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。
5、标准稀碘液。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。
2、不同温度对α-液化淀粉酶活力的影响
取4根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。
加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。
3、不同PH值对α-液化淀粉酶活力的影响
取5根Φ25×200mm 试管，按下表配制反应溶液。
其它操作与温度对酶活力影响实验相同。
五、结果计算和讨论
淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g 酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。
酶活力单位(U/g)=
n t ⨯⨯⨯⨯5
.01
02.02060 式中：20——可溶性淀粉的用量（mL ）； t ——酶解反应完成所需的时间（min
）； 0.5——测定时稀释酶液用量（mL ）； 0.02——可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL ）； n ——酶制剂稀释倍数
1、不同温度对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录
2、不同pH 值对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录
分别以PH值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制PH值—酶活力单位、温度—酶活力单位图。
讨论分析实验结果。
六、思考题
1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？
2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？
3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？
4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？
5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？。