低温脂肪酶基因的异源表达
低温脂肪酶基因的异源表达
引言
低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。
现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶 。
Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。
(1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。
(2)分泌子(secreton)介导的分泌。这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。
(3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。
Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia
的脂肪酶可以分泌。但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。Feller研究发现，莫拉氏菌TA144的脂肪酶在大肠杆菌中表达后，培养物的上清液几乎没有酶活性，而菌悬液有一定的酶活力，说明脂肪酶没有分泌到胞外，而是存在与外周质空间或镶嵌于细胞膜上。迄今为止，已经有多例低温脂肪酶能用基因工程技术成功表达的报告。Choo等 将分离自阿拉斯加土壤的适冷的假单胞杆菌的低温脂肪酶基因在大肠杆菌中表达。其最适pH为8．0左右，在45℃时酶活力最高。以对硝基苯月桂酸酯为底物计算酶的活化能为7．7kcal／mol，低于其它南极适冷菌的12~~~~~~~17 kcal／mol，和中温铜绿假单胞菌的25 kcal／mol。Feller_9 报道了一株南极适冷型莫拉氏菌的脂肪酶基因在中温型大肠杆菌中的克隆与表达。结果发现，包含有耐冷型脂肪酶编码基因的克隆只有在
生长温度从对应嗜温菌的最适生长温度37℃ 降至25~C或17℃ 以后，才表达有酯解活力脂肪酶，从而防止基因产物的热变性，重组酶的最适温度比野生型低了10~C，而且异源表达的脂肪酶比野生型具更明显的热不稳定性。Rashid[1 将深海分离出的假单胞杆菌KB700A脂肪酶基因在大肠杆菌中成功表达。其基因序列与中温菌P． P．fluorescens 的脂肪酶基因的序列同源性可达90％ ，该脂肪酶只有在Ca 作用下才表现酶活力，另外添加Mn2+ 、Sr2+ 等离子以及去垢剂皆可提高酶活。 迄今为止虽然只有很少几种低温脂肪酶基因得到克隆和测序，但通过表达型质粒将脂肪酶基因克
隆到适合于工业化生产的工程菌中，可使脂肪酶的发酵产率获得极大的提高。
1 实验
1．1 菌株、质粒与培养基
大肠杆菌JM109和BL21(DE3)、克隆／表达载体pET-30a，均为本实验室保存。质粒pUAMT为p13C19上克隆有1．9 kb带有自身信号肽的假单胞杆菌耐酸性高温
低温脂肪酶突变基
因amyd(成熟肽134位的L-亮氨酸变为L一精氨酸、320位的L-丝氨酸变为L一丙氨酸，其它序列同假单胞杆菌耐高温 低温脂肪酶基因)重组载体，由本实验室构建。菌体培养均用LB液体培养基。筛选培养基是含100 g·mL 卡那霉素的LB琼脂培养基。
1．2 工具酶和试剂
Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标准、纯化DNA片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒，Takara公司；卡那霉素、T4 DNA连接酶、蛋白质分子量标准，上海生物工程有限公司；引物合成由上海Invitrogen生物公司完成。
1．3 DNA的提取及操作
质粒的快速提取、检测及DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备、转化按文献E5]进行。
1．4 PCR扩增及重组质粒构建
根据假单胞杆菌耐酸性高温 低温脂肪酶突变基因，去除其自身信号肽，设计引物，利用PCR得到其成熟肽序列，上游引物P1：5 一C TGCCA] GCTG—CAAATCTTAATGGGACGCT-3 (下划线部分为Ⅳc0I酶切位点)，下游引物P2：5 一CCCAA n]_r0叩一GA0G( TG TGACACTT-3 (下划线部分为HindⅢ酶切位点)。以质粒pUAMT 为模板扩增amyd基因。将PCR产物及提取的质粒pET-30a，分别用Nco I和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4 DNA连接酶于16℃ 连接过夜，电转化大肠杆菌JMlO9，卡那霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序。再将阳性转化子的质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)中诱导表达。
1．5 目的蛋白的诱导表达
将构建好的工程菌株BL21／pET—amyd和对照菌BL21／pET一30a分别接种于2 mL LB液体培养基中，37~C水浴振荡培养过夜，按1％ 的接种量转接于装有30 mL培养基的250 mL三角瓶中继续培养3．5 h，加入IPTG(终浓度为1 mmol·L )，30℃
诱导表达。4 h后，4000 r·min 冷冻离心收集菌体，将菌体悬于pH值6．0的磷酸缓冲液中，冰浴超声。超声波功率为400 W，超声10次，每次10 S，间隔2 min。12 000 r·min 离心破碎液，分别取上清液和沉淀用于SDSPAGE(分离胶含量为10％ ，浓缩胶含量为5 )，检测蛋白的表达情况。
1．6 蛋白含量的测定
采用Folin一酚法：以牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，样品适当稀释后在640 nm下得到的吸光度值查标准曲线，得出蛋白含量。
1．7 酶活检测
测定方法和其它溶液的配制参照中华人民共和国行业标准(QB／T 2306—97)“耐高温 脂肪酶制剂”。脂肪酶活性单位(U)的定义：在70℃ 、pH值5．0的条件下，每分钟液化1 mg可溶性淀粉产生的糊精所需的酶量为一个酶活性单位。酶活按下式计算：X—C×n×16．67
式中：X 为样品的酶活力，U ·mL-1；C为测试酶的浓度，U t mL_。；n为样品的稀释倍数；16．67为换算系数。
1．8 重组酶的分离纯化
1．8．1 盐析
收集工程菌BL21／pET—amyd的超声破碎上清液，分成15份，每份(50 mL)加硫酸铵分别至饱和度为2O 、25％、3O％ 、35 、40％ 、45 、50 、55％ 、60 、65 、70％、75 、80％、85 、90 ，4"C静置过夜，6000 r·min-1离心20 min，蛋白沉淀用适量生理盐水溶解，分别测定沉淀和上清液的酶活，绘制硫酸铵盐析曲线，根据盐析曲线进行硫酸铵分步盐析制备粗酶沉淀。
1．8．2 DEAE—Sepharose Fast Flow(2．4 cm ×30 cm)
离子交换层析
用0．02 mol·L～ Tris—HC1(pH 值7．6)缓冲液平衡层析柱，将盐析脱盐后得到的活性组分用同样的缓冲液溶解，6000 r·min 离心10 min，上样(2 mL)后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0．1 mol·L-1 NaC1的0．02
mol·L_。Tris—HC1(pH值7．6)缓冲液梯度洗脱，分步收集，测定A 。。吸光度值和酶活力。
1．8．3 Sephadex G-75(1．6 cm×80 cm)凝胶层析
离子交换得到的活性组分先用含0．15 mol·L NaC1的0．02 mol·L Tris-HCI(pH值7．6)缓冲液平衡，6000 r·min 离心10 rain，上样(2 mL)后用相同的缓冲液以0．5 mL·rain 的速度洗脱，每管收集2．0 mL，紫外检测器在线检测A 。。，收集活性
2．结束语
综上所述，低温脂肪酶以其独有的优势正越来越成为各国家研究的热点，尽管如今对其性质以及结构等方面有了一定的了解，但都是零星的，还不够全面。相信随着酶学研究的深入，酶工程的发展，低温脂肪酶在生物催化和生物转化中的应用一定将会进一步得到拓展。
参考文献
[1] Thomas DN et a1．Science，2002，295：641—644
[2] Feller G．FEMSMicrobiology Letters，1990，66：239-244
l 3I Feller G et a1．Microbioz Biotechnol，1994．41：477 79
[4] Arpigny JL et a1．Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic，
1997．3：29—-35
[5] 陈熹兮等． 自然杂志．2001，23(3)：163—167
[6] Zecchinon et a1．Extremophiles，2001，5：313—321
[7] Arpigny JL et a1．Biochim Biophy,Aaa，1993，1171：331—333
l 8} Choo DW et a1．Appl Environment Microbiaz，1998，486 91
[9] Feller G．Biochim日却伽Acta，1991，1088：323—324
[1O] Feler G et a1．DNA and Cell Biology，1991，10：381-388
[11] FeUerG．NucleicAcids Res，1990，18：6432
[12] G№ F．Chemistry and Physics of却 ，1998，93：15—25
[13 J Rosenau F et a1．Biochimie，2000，82：1023— 1o32
[14] Quyen DT et a1．Appl Environment Microbial，1999，787—794
低温下寒地冬小麦部分冷相关基因和脂肪酸代谢关键酶基因定量分析的开题报告
低温下寒地冬小麦部分冷相关基因和脂肪酸代谢关键酶基因定量分析的开题报告
题目：低温下寒地冬小麦部分冷相关基因和脂肪酸代谢关键酶基因定量分析
背景：
寒地冬小麦是我国北方地区重要的粮食作物之一，其产量和品质受到气候变化的影响较大。其中，低温是常见的气候因素之一，对冬小麦的生长和发育具有重要影响。因此，研究低温下冬小麦的适应机制和相关基因是提高其产量和品质的重要途径之一。
研究内容：
本研究将通过定量PCR技术，对低温下寒地冬小麦的部分冷相关基因和脂肪酸代谢关键酶基因进行定量分析。具体研究内容如下：
1. 筛选低温下表现出明显适应性的冬小麦品种和对照品种；
2. 提取冬小麦的总RNA，通过RT-PCR技术合成cDNA；
3. 选取已知的部分冷相关基因和脂肪酸代谢关键酶基因，设计引物，利用定量PCR技术对样品中的基因表达水平进行定量分析；
4. 分析不同品种和处理下，部分冷相关基因和脂肪酸代谢关键酶基因的表达差异；
5. 分析基因表达的差异对冬小麦适应低温的作用。
意义：
本研究将有助于深入了解冬小麦适应低温的分子机制，为小麦遗传改良、提高产量和提高品质提供重要的理论参考。
白地霉低温脂肪酶的研究的开题报告
白地霉低温脂肪酶的研究的开题报告
一、背景
脂肪酶是一类能够加快三酰甘油、磷脂和胆固醇等脂类物质在水中水解反应速率的酶类。在食品、制药、医学等行业中广泛应用，是一种重要的酶类制品。目前，市场上的脂肪酶主要来源于微生物、植物和动物，其中以微生物脂肪酶的应用最为广泛。白地霉是一种来源广泛、生长适应性强的真菌，被认为是脂肪酶的优良产生菌。
二、研究目的
本研究的目的是通过对白地霉产生的脂肪酶进行深入分析和研究，探索其在低温反应条件下的酶学特性，进一步优化脂肪酶产出工艺和酶学性能，为其在工业应用中的推广奠定基础。
三、研究内容
1.白地霉菌株的筛选和鉴定
本研究中将通过对不同环境样本的采集和筛选，寻找到适宜生产脂肪酶的白地霉菌株，并通过形态学、PCR扩增、16S rRNA序列分析等方法对其进行鉴定。
2.脂肪酶发酵条件的优化
采用响应面分析法，以菌株筛选结果为基础，确定最适合生产脂肪酶的菌株和发酵条件。
3.脂肪酶的提取和纯化
通过离心、沉淀和柱层析等方法对发酵液中脂肪酶进行提取和纯化，获得高纯度的脂肪酶。
4.脂肪酶的酶学性质的分析
对获得的脂肪酶进行酶学特性的分析，包括温度、pH、离子强度、金属离子等因素对酶的生物学活性的影响。
5.脂肪酶在低温条件下的活性研究
通过定量测定法研究脂肪酶在低温条件下的反应活性、抑制剂作用以及酶学网络模型的构建等。
四、研究意义 本研究将为优化脂肪酶的产出工艺、提高酶学性能和推广应用等方面提供有益的参考和支持，对相关学科领域的研究有一定的推动作用。同时，也将为其他微生物菌株的脂肪酶研究及其实际应用提供一定的借鉴意义。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述
摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术
1.脂肪酶概述
脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质
在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或
Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶
2 中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物
微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达
无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达
黑曲霉作为一种重要的工业生产菌株,已逐步开发成为一种重要的酶表达系统。在本研究中,首先选择一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株为表达宿主,并对农杆菌介导转化法和PEG-原生质体转化法进行条件优化,然后以脂肪酶为模式酶在黑曲霉中进行同源/异源脂肪酶的表达。
通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表达量,并进行了酶学性质研究。最后初步开展了CRISPR/cas9技术在黑曲霉表达系统中的应用,构建了尿嘧啶缺陷型菌株。
主要结果如下:（1）对农杆菌介导转化和PEG-原生质体转化两种方法进行了条件优化。优化后农杆菌介导转化的条件是不萌发的新鲜孢子与OD600培养至0.9-1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol·L-1的IM平板上,23 oC避光培养48
h后进行转膜。
最佳转化效率大约为每106个孢子获得60±5个转化子,并且阳性率保持在90%以上。原生质体制备条件为:107个?mL-1黑曲霉孢子接种PDA浸提液,30 oC,200 r·min-1培养24 h,收集菌丝体,按质量体积比1:10加入裂解酶液(0.8 mol·L-1
MgSO4,1%纤维素酶,0.5%蜗牛酶,0.25%溶菌酶),37
oC,120 r·min-1酶解2.5 h后收集原生质体,获得原生质体个数约6.8×105个?mL-1,原生质体再生率约63±2.5%。
（2）将同源及异源蛋白在黑曲霉中进行表达,异源华根霉脂肪酶RCL在黑曲霉CICC2169中未能表达,同源黑曲霉脂肪酶ANL可以表达但表达量较低。启动子转录水平分析,诱导型启动子glaA转录水平相比于野生型提高50.35倍,而组成型启动子gpdA转录水平相比于野生型提高994.86倍。
尝试3种方式来提高ANL的表达水平,包括补充内含子（提高mRNA的稳定性）、添加kozak序列（增强翻译效率）、不同信号肽（增强蛋白胞外分泌效率）。在均是glaA为信号肽的前提下,改造之前初始转化子检测不到酶活力,单补充内含子的转化子酶活约为75.80 U?mL-1,单添加kozak序列的转化子酶活约为61.33 U?mL-1,信号肽的影响效果为cbhⅠsignal>ANL
微生物发酵生产脂肪酶的研究
微生物发酵生产脂肪酶的研究
摘 要：脂肪酶是一种重要的工业用酶, 广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。酶的开发和应用具有巨大市场前景。一般情况下酶被利用在日常食品的发酵，以及洗涤剂、制药等新的领域的应用，同时因为酶的重要性脂肪酶也受到广泛关注。市场对脂肪酶的需求不断增长，从而使对于生产脂肪酶的研究也在不断的提高，现在的市场上较多情况都是利用微生物的发酵来制造和生产脂肪酶。但是由于目前商业化的脂肪酶成本相对较高，因此探索如何去提高脂肪酶的产量以及利用率是目前需要解决的问题。我们通过研究发现传统的发酵培养技术降低了脂肪酶的生产成本，同时可以很好的提高生产脂肪酶的效率。
关键词：脂肪酶;微生物;发酵
作为重要的工业用酶, 广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域。1984 年, Zaks 和 Klibano在有机溶剂体系中, 以脂肪酶粉为催化剂, 成功地催化合成了一系列有机化合物。该研究揭开了非水相酶学的研究序幕,
并迅速成为应用酶学研究中最为活跃、发展最为迅速的领域。脂肪酶是非水相酶学中最为重要的一类酶。显著不同于在水相体系中的水解反应特性, 脂肪酶在非水相体系中具有良好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性。该特性使脂肪酶可被广泛地应用于生物能源( 生物柴油) 、药物合成等应用前景广阔的领域。脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中。动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等, 而植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子。而微生物脂肪酶种类最多, 广泛存在于细菌、酵母和霉菌中, 最易获得和大规模生产, 且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性, 因此是工业用脂肪酶的重要来源。自20世纪初首次发现以来, 便得到广泛研究和应用。近20年来, 微生物脂肪酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面, 其中脂肪酶工程化技术的研究是其能否实现工业化生产的关键。 一、什么是脂肪酶以及脂肪酶如何生产
betA基因的异源表达提高了棉花耐盐和耐低温能力的开题报告
betA基因的异源表达提高了棉花耐盐和耐低温能力的开题报告
引言：
棉花是世界性的重要纺织作物之一，以其生长迅速、纤维细长、纤维强度高的特点为人们所熟知。然而，在种植棉花的过程中，棉花受到多种逆境因素的影响，尤其是盐渍化和低温环境等，极大地限制了棉花的产量和品质，给棉花生产带来了极大的损失。
Methods:
本文选择棉花中与逆境反应密切相关的基因betA为研究对象，构建了betA基因的异源表达载体，利用农杆菌介导法将其转化至棉花叶片中，通过PCR、Western blot和RT-PCR等多种方法对betA基因的转化和表达效果进行检测和分析，同时对转基因棉花在盐胁迫和低温胁迫下的表型变化、抗氧化酶活性和相关基因表达进行了研究。
Results:
本研究的结果表明，通过betA基因的异源表达，可以显著提高棉花在盐渍化和低温环境下的生长和发育能力，同时对于过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性也有显著的升高。此外，我们还发现，betA基因的转化可以明显提高棉花中相关逆境相关基因的表达水平，包括了CBL和CIPK基因，这可能是betA基因产生生理效应的主要原因。
Conclusions:
综上所述，本研究的结果展示出了通过betA基因的异源表达可以提高棉花耐盐和耐低温能力的可能性，并且初步探讨了betA基因在逆境抗性中的分子机制。由此，我们认为betA基因的表达可能成为开发增强棉花耐逆性的一种新途径。
低温脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达研究
第３Ｏ卷第１期 ２０１２年１月 海洋科学进展 ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＭＡＲＩＮＥ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖｏ１．３Ｏ Ｎｏ．１ Ｊａｎｕａｒｙ，２０１２
低温脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达研究
刘 羽 ，王能飞 ，黄亦钧。，林学政 ，沈继红
（１．中国海洋大学，山东青岛２６６００３；２．国家海洋局第一海洋研究所， 山东青岛２６６０６１；３．青岛康地恩生物科技有限公司，山东青岛２６６０６１）
摘 要：将已有的低温脂肪酶基因克隆至表达载体ｐＰＩＣＺａ上，并转化毕赤酵母Ｘ一３３。在低温条件下诱导培养６ ｄ 后，发酵液中可检测到低温脂肪酶活力。重组酵母发酵液加入二硫苏糖醇后单位酶活力达到３２ Ｕ／ｍＬ，与未加入 该试剂的原始菌株相比提高４倍以上。对重组脂肪酶的酶学性质研究表明，其最适ｐＨ为８．０，最适温度为３５℃， ５Ｏ℃温浴３０ ｍｉｎ后，仍有３Ｏ．Ｏ４ 的活性。以不同碳链长度的４－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｅｓｔｅｒ为底物检测其底物特异性，结 果显示其较适合作用于短链底物。重组酵母能够在ＢＭＭＹ培养基中胞外分泌表达带有Ｈｉｓ标签的重组脂肪酶， 经镍柱纯化后，ｓＤＳ－ＰＡＧＥ检测可得到大约３５ ｋＤａ的单一蛋白质条带。 关键词：低温脂肪酶；重组蛋白；毕赤酵母；组氨酸标签 中图分类号：Ｑ９３３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７Ｉ－６６４７（２０１２）０１－０１５５一Ｏ８
脂肪酶（ＥＣ：３．１．３．３）是一类水解油脂的酶类，可催化油水界面的甘油三酯水解生成甘油及长链脂肪 酸。脂肪酶可应用于食品加工、油脂化学、精细化工、手性化合物拆分、高分子材料制备、生物柴油合成、去污 剂添加剂等诸多工业领域＿１］。工业中使用的脂肪酶多为中温酶，其最适作用温度为５Ｏ℃。与中温酶相比，
低温脂肪酶的优点是活化能较低，在低温条件下具有高酶活 ］。低温脂肪酶在节能环保方面具有良好的应 用潜力，因而成为酶学研究新的热点。 迄今，已有部分低温脂肪酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达Ｌ３］。然而，低温脂肪酶在大肠杆菌中易形成
南极深海沉积物中微生物低温脂肪酶的筛选和基因克隆表达
南极深海沉积物中微生物低温脂肪酶的筛选和基因克隆表达
从南极深海沉积物中筛选到一产脂肪酶的菌株Lip001,细胞呈短杆状,单个排列,无鞭毛,大小为0.5～0.8μm×1～1.5μm,为革兰氏阴性菌;生长温度范围在5～30℃(最适生长温度为10～20℃),生长pH范围在4～10之间(最适生长pH值为6～8),生长盐度范围在0～8%之间(最适生长盐度为范围为1～4%)。菌株Lip001能够分解多种单一碳源并产生脂肪酶,最适产酶温度、时间和pH值分别为20℃下、24小时和pH6～8。粗酶液经硫酸铵盐析、Q Sepharose XL柱层析、Sephadex G-75凝胶过滤后,获得了单一条带的电泳纯酶,其分子量大小为55kDa,并对纯化后的蛋白酶进行酶学性质的研究。该脂肪酶的最适反应pH值为9～10,最适反应温度为35℃,是典型的低温碱性脂肪酶,对热敏感。高浓度的变性剂和EDTA都能抑制该脂肪酶,且金属离子对酶活性中心构象有关键性的影响。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)对该脂肪酶有较为明显的激活作用,而Cd~(2+)、Co~(2+)和Zn~(2+)则能抑制酶活。通过构建Lip001基因组DNA的Fosmid文库,获得一段编码羧酸酯酶的基因,氨基酸序列分析其属于脂肪酶超级家族中的一员。从南极深海沉积物中筛选到一产脂肪酶的菌株Lip004,利用普通PCR和染色体步移的方法获得了脂肪酶基因lipA,构建重组表达载体,在大肠杆菌中获得表达,表达后的重组蛋白也得到了纯化。该研究结果及其所建立的技术为南极丰富的低温酶资源的研究开发奠定了基础。提取西太平洋“暖池”区深海沉积物样品总DNA,利用异化型亚硫酸盐还原酶(DSR)和甲基辅酶M还原酶(MCR)基因的简并引物,采用PCR-RFLP方法对沉积物样品中这两类功能基因多样性进行研究。该沉积物中的dsrAB基因分别来源于δ-变形菌中的6个属,其中最多的是脱硫弧菌属和脱硫杆状菌属;mcrA基因均来源于产甲烷古菌,其中主要是甲烷微菌。这些基因在系统发育树上都处于相对独立的分支。此外,还有较多的dsrAB,mcrA基因来源于未知的新属或新种。这些结果表明该海区沉积物中由微生物参与的硫和甲烷循环比较活跃,而且其中可能存在多种新的代谢途径。本论文是在国家高技术研究发展计划(863计划,2007AA091407)和中国大洋协会项目(DYXM-115-02-2-04)资助下完成的。
低温微生物脂肪酶的研究进展
吏1
[摘要l低温条件下徽生物脂肪醉具有高效、封热、作用周期短等优势.其独特的低温适应机制是中高温脂肪醉无法替代的，并
在许多领城得到了广泛的应用。本文从微生物脂肪酶的功能、筛选的影响因素、结构特征和化学修饰、诱变和提取分离方法、固定
化、研究现状进行了论述，这对于广大的科研工作者具有一定的参考价值。[关键词」低温微生物脂肪酶;功能;诱变;提取和分离
1、微生物脂肪酶的功能和研究历史脂肪酶(Iipase,EC3.1.13，甘油醋水解酶)，分解生物产生的各种天
然的油和脂肪，是一类特殊的酷键水解酶，主要水解由甘油和12碳原
子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酷，催化的反应式是三酸甘油醋和水在脂肪酶的作用下生成二酸甘油醋和脂肪酸。其另一个催化特征功能是一种专门在异相系统油水界面上水解特殊酷类的酶，对
均匀分散的或水溶性底物不起作用，以底物甘油三酷中1位或3位和
2位酷键的识别和水解反应性一酷键位置专一性最为关键，这是脂肪
酶区别于MH酶的一个特征。脂肪酶广泛存在于各种动植物的组织中和
各种微生物中，它是最早研究的酶类之一，动植物脂肪酶于十九世纪
被首次报道，而微生物脂肪酶则是在本世纪被发现和研究当中，几乎
所有的微生物都有合成脂肪酶的能力，只是合成的能力不同而已，由
于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，作用高效，具有比动植物脂
肪酶广的PH值，作用温度范围和对底物的专一性类型，又便于进行工业化生产和获得纯度制剂，所以比动植物脂肪酶在酶理论研究和实际应用中有着更为重要的作用.近五年来，仅被DERWERT生物技术
文摘收录的脂肪酶文献就多达4001)多篇，其中日本、美国的专利文献占了近1/4,涉及有机合成、制药、油脂加工、轻化等众多行业，充分另
示了其巨大的应用潜力。
2、产低温微生物脂肪酶菌株的筛选根据相关文献报道，产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在根酶Rhizopus、曲霉Aspergillus、青酶Penicillium、毛酶Mucor、须霉
低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究
低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究
王培培;刘晓宁;林国秀;李珍;唐瑗;张杰
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】2011(41)6
【摘 要】A lipase-producing strain w as isolated from soil sam ples
colleted from the Rolg(e) plateau by screening w ith plates containing
Tween 80 and the shaking flask ferm entation. A ccording to the m
orphological and physiological characteristics, it was identified and
named as Pseudom onas sp . D L-B . The op tim al ferm entation
conditions for producing lipase w ere investigated by orthogonal test. T he
op tim alferm enlation m edium conlained : 10 g/L sucrose , 20 g/ L
peptone, 10 mL/L lard oil, 0 .5 g/L M gSO4 7H2O , 1 g/L K2H PO4 , 5 m L/L
Tween 80; The culture condition w as 40 m L m edium w ith Erlenm eyer
flask of 250 m L at35 ℃ and initialpH 7 .0 . The op tim alpH and tern
perature for enzym at ic reaction w ere pH 9 .0 and 25℃.A s a result, its