低温脂肪酶基因的异源表达

低温脂肪酶基因的异源表达
引言
低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。

决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。

低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。

现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。

如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。

革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶。

Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。

(1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。

这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。

ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。

三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。

(2)分泌子(secreton)介导的分泌。

这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。

(3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。

通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。

脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。

Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia
的脂肪酶可以分泌。

但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。

有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。

Feller研究发现，莫拉氏菌TA144的脂肪酶在大肠杆菌中表达后，培养物的上清液几乎没有酶活性，而菌悬液有一定的酶活力，说明脂肪酶没有分泌到胞外，而是存在与外周质空间或镶嵌于细胞膜上。

迄今为止，已经有多例低温脂肪酶能用基因工程技术成功表达的报告。

Choo等将分离自阿拉斯加土壤的适冷的假单胞杆菌的低温脂肪酶基因在大肠杆菌中表达。

其最适pH为8．0左右，在45℃时酶活力最高。

以对硝基苯月桂酸酯为底物计算酶的活化能为7．7kcal／mol，低于其它南极适冷菌的12~~~~~~~17 kcal／mol，和中温铜绿假单胞菌的25 kcal／mol。

Feller_9 报道了一株南极适冷型莫拉氏菌的脂肪酶基因在中温型大肠杆菌中的克隆与表达。

结果发现，包含有耐冷型脂肪酶编码基因的克隆只有在生长温度从对应嗜温菌的最适生长温度37℃降至25~C或17℃以后，才表达有酯解活力脂肪酶，从而防止基因产物的热变性，重组酶的最适温度比野生型低了10~C，而且异源表达的脂肪酶比野生型具更明显的热不稳定性。

Rashid[1 将深海分离出的假单胞杆菌KB700A脂肪酶基因在大肠杆菌中成功表达。

其基因序列与中温菌P． P．fluorescens 的脂肪酶基因的序列同源性可达90％，该脂肪酶只有在Ca 作用下才表现酶活力，另外添加Mn2+ 、Sr2+ 等离子以及去垢剂皆可提高酶活。

迄今为止虽然只有很少几种低温脂肪酶基因得到克隆和测序，但通过表达型质粒将脂肪酶基因克
隆到适合于工业化生产的工程菌中，可使脂肪酶的发酵产率获得极大的提高。

1 实验
1．1 菌株、质粒与培养基
大肠杆菌JM109和BL21(DE3)、克隆／表达载体pET-30a，均为本实验室保存。

质粒pUAMT为p13C19上克隆有1．9 kb带有自身信号肽的假单胞杆菌耐酸性高温低温脂肪酶突变基
因amyd(成熟肽134位的L-亮氨酸变为L一精氨酸、320位的L-丝氨酸变为L一丙氨酸，其它序列同假单胞杆菌耐高温低温脂肪酶基因)重组载体，由本实验室构建。

菌体培养均用LB液体培养基。

筛选培养基是含100 g·mL 卡那霉素的LB 琼脂培养基。

1．2 工具酶和试剂
Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA分子量标准、纯化DNA片段的琼脂糖凝胶回收试剂盒，Takara公司；卡那霉素、T4 DNA连接酶、蛋白质分子量标准，上海生物工程有限公司；引物合成由上海Invitrogen生物公司完成。

1．3 DNA的提取及操作
质粒的快速提取、检测及DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备、转化按文献E5]进行。

1．4 PCR扩增及重组质粒构建
根据假单胞杆菌耐酸性高温低温脂肪酶突变基因，去除其自身信号肽，设计引物，利用PCR得到其成熟肽序列，上游引物P1：5 一C TGCCA] GCTG—CAAATCTTAATGGGACGCT-3 (下划线部分为Ⅳc0I酶切位点)，下游引物P2：5 一CCCAA n]_r0叩一GA0G( TG TGACACTT-3 (下划线部分为HindⅢ酶切位点)。

以质粒pUAMT 为模板扩增amyd基因。

将PCR产物及提取的质粒pET-30a，分别用Nco I 和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，电转化大肠杆菌JMlO9，卡那霉素抗性平板筛选转化子，分别用PCR和双酶切法进行鉴定，并挑取阳性转化子进行测序。

再将阳性转化子的质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)中诱导表达。

1．5 目的蛋白的诱导表达
将构建好的工程菌株BL21／pET—amyd和对照菌BL21／pET一30a分别接种于2 mL LB液体培养基中，37~C水浴振荡培养过夜，按1％的接种量转接于装有30 mL 培养基的250 mL三角瓶中继续培养3．5 h，加入IPTG(终浓度为1 mmol·L )，30℃诱导表达。

4 h后，4000 r·min 冷冻离心收集菌体，将菌体悬于pH值6．0的磷酸缓冲液中，冰浴超声。

超声波功率为400 W，超声10次，每次10 S，间隔2 min。

12 000 r·min 离心破碎液，分别取上清液和沉淀用于SDSPAGE(分离胶含量为10％，浓缩胶含量为5 )，检测蛋白的表达情况。

1．6 蛋白含量的测定
采用Folin一酚法：以牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，样品适当稀释后在640 nm下得到的吸光度值查标准曲线，得出蛋白含量。

1．7 酶活检测
测定方法和其它溶液的配制参照中华人民共和国行业标准(QB／T 2306—97)“耐高温脂肪酶制剂”。

脂肪酶活性单位(U)的定义：在70℃、pH值5．0的条
件下，每分钟液化1 mg可溶性淀粉产生的糊精所需的酶量为一个酶活性单位。

酶活按下式计算：X—C×n×16．67
式中：X 为样品的酶活力，U ·mL-1；C为测试酶的浓度，U t mL_。

；n为样品的稀释倍数；16．67为换算系数。

1．8 重组酶的分离纯化
1．8．1 盐析
收集工程菌BL21／pET—amyd的超声破碎上清液，分成15份，每份(50 mL)加硫酸铵分别至饱和度为2O 、25％、3O％、35 、40％、45 、50 、55％、60 、65 、70％、75 、80％、85 、90 ，4"C静置过夜，6000 r·min-1离心20 min，蛋白沉淀用适量生理盐水溶解，分别测定沉淀和上清液的酶活，绘制硫酸铵盐析曲线，根据盐析曲线进行硫酸铵分步盐析制备粗酶沉淀。

1．8．2 DEAE—Sepharose Fast Flow(2．4 cm ×30 cm)
离子交换层析
用0．02 mol·L～ Tris—HC1(pH 值7．6)缓冲液平衡层析柱，将盐析脱盐后得到的活性组分用同样的缓冲液溶解，6000 r·min 离心10 min，上样(2 mL)后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0．1 mol·L-1 NaC1的0．02 mol·L_。

Tris—HC1(pH值7．6)缓冲液梯度洗脱，分步收集，测定A 。

吸光度值和酶活力。

1．8．3 Sephadex G-75(1．6 cm×80 cm)凝胶层析
离子交换得到的活性组分先用含0．15 mol·L NaC1的0．02 mol·L Tris-HCI(pH 值7．6)缓冲液平衡，6000 r·min 离心10 rain，上样(2 mL)后用相同的缓冲液以0．5 mL·rain 的速度洗脱，每管收集2．0 mL，紫外检测器在线检测A 。

，收集活性
2．结束语
综上所述，低温脂肪酶以其独有的优势正越来越成为各国家研究的热点，尽管如今对其性质以及结构等方面有了一定的了解，但都是零星的，还不够全面。

相信随着酶学研究的深入，酶工程的发展，低温脂肪酶在生物催化和生物转化中的应用一定将会进一步得到拓展。

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