人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达

ISSN 1007 7626CN 11 3870 Q中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2003年6月19(3):312~316人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达李体远, 杜 珙*, 蔡筱彦, 石之磷, 黄瑞芳, 陈德珩, 戴 勇, 肖德明(暨南大学医学院第二附属医院,深圳市人民医院临床医学研究中心,深圳 518020)摘要 将编码人组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段扩增并分别克隆到原核表达载体pE T28(b)及分泌型表达载体pE T20(b)中,使其C 端融合6 His Tag 序列.转化不同受体菌,IPTG 诱导表达后利用SDS PAGE 、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析.在6株基因工程菌株中,均表达出分子量约30kD 的激肽释放酶融合蛋白,其中激肽释放酶在pET28载体中的表达水平高于pET20载体.pE T28和pE T20载体表达的重组激肽释放酶蛋白分别占菌体总蛋白约26%和10%.Western 印迹分析表明,目的蛋白可与抗人血清KK 单克隆抗体发生特异性反应.未经纯化的激肽释放酶融合蛋白具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯(B AEE)的能力.在大肠杆菌中获得了人组织激肽释放酶的高效表达,表达产物具有免疫原性和生物活力,这为研究其生物功能和开发基因工程药物奠定基础.关键词 人组织激肽释放酶,大肠杆菌,高效表达中图分类号 Q78Overexpression of Mature Human Tissue KallikreinFusion Protein in E .coliLI Ti yuan,DU Gong *,C AI Xiao yan,SHI Zhi lin,HUANG Rui fang,C HE N De heng,DAI Yong,XI AO De ming(Me dical Researc h Cente r ,Shenzhe n People s Hospital ,Medic al Colle ge ,Jinan U nive rsity ,Shenzhe n 518020,China )Abstract Human tissue kallikrein gene fragment encoding mature kallikrein was amplified and cloned into pE T 28(b)and pET 20(b)plasmid with C terminal 6 His Tag.The recombinant fusion protein was overe xpressed in B L21(DE3),B L21(DE3)plysS and HMS174(DE3)under the induction of IPTG.SDS PAGE showed tha t the kallikrein fusion protein were produced at a level of approximately 26%and 10%of the total cellular protein in E .coli BL21(DE3)plysS by pET 28(b)and pET 20(b),respectively.The relative molecular weight of the expressed protein was 30kD.Western blot analysis indicated that the expressed kallikrein had the antigenicity to human serum kallikrein.The kallikrein fusion protein in the un purified solution sho wed low activity to hydrolysis B AEE by using potentiometric method.The overe xpressed human tissue mature kallikrein could be used for the development of gene tic engineering products and further study of its biological property.Key words kallikrein,overexpression,E .coli 收稿日期:2002 05 28,接受日期:2002 10 28基金项目:深圳市科技局资助课题(No.199906014),广东省十五攻关课题(No.C11801)李体远,男,1964年1月生,博士,副研究员,现在美国Ohi o 州立大学做博士后研究工作*联系人:Tel:0755 ******** 2599,Fa x:0755 ********E mail:tiyuanl@Supported by Shenzhen Bureau of Science and Technology (No.199906014)and the 10th Fi ve Year Plan Special Research Programs of Guangdong Province (No.C11801)Recei ved:May 28,2002;Accepted:October 28,2002*Corres pondi ng author Tel:0755 ******** 2599,Fax:0755 ********E mail:tiyuanl@高血压为最常见的心血管疾病,同发达国家一样,我国的发病率呈逐年升高趋势.据全国统计资料显示,我国现有高血压患者已达一亿,每年新增300万以上.肾脏等疾患同样威胁着广大人民的健康.研制开发新的抗高血压、改善肾脏功能等药物具有广阔的经济价值及深远的社会效益.激肽释放酶(kallikrein,KK)具有广泛的药用价值,除降血压之外,还可以用于治疗糖尿病肾病、改善肾脏功能,治疗心、脑血管疾病等[1~5].猪源激肽释放酶生化药物已经上市,并在治疗糖尿病肾病等疾病中取得肯定疗效.由于种属差异,人源激肽释放酶在蛋白结构、生物活性、免疫反应以及治疗效果等方面都必将优于猪胰激肽释放酶.我们利用pE T表达系统,在大肠杆菌中高效表达了人组织成熟激肽释放酶融合蛋白,表达产物纯化后不仅可以用于抗体制备,也为进一步大规模生产人源激肽释放酶基因工程药物奠定基础.1 材料与方法1 1 质粒、菌珠质粒pE T28b载体,含T7噬菌体启动子,N端携带His亲和Tag、凝血酶基因、T7Tag以及可选择的C 端His亲和Tag;质粒pET20b载体,含T7噬菌体启动子,N端携带向细胞质分泌定位外源蛋白的信号序列以及可选择的C端His亲和Tag.E.coli B L21和BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、HMS174(DE3)为pE T系统高效表达对照和宿主菌,均为金宁一博士(解放军军需大学研究所,病毒病研究室)惠赠,本室保存.质粒pBluescript!KS(+),大肠杆菌XL1 Blue 分别购于STRATAGE NE(晶美公司).质粒KSKK含人组织激肽释放酶完整基因,由作者克隆和构建.法国VL凝胶分析系统.1 2 工具酶及生化试剂限制性内切酶、大肠杆菌DNA聚合酶∀大片段(Klenow)、T4DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)、RNA酶、DNA酶∀、溶菌酶、高保真pfu Taq 酶、DNA胶回收试剂盒和相关化学试剂等为QIAGE N、Ne w England Biolabs、MBI、Stragene、Inivitrogen产品,分别购自深圳晶美公司、广州gene 公司、上海生物工程公司等.抗人血清激肽释放酶抗体、猪胰腺激肽释放酶标准品购自Sigma公司.1 3 PCR引物设计及合成根据KK氨基酸序列中的蛋白酶切割位点,利用计算机辅助系统(Primer5.0)设计PCR引物,由上海生工公司合成并经聚丙烯凝胶电泳纯化.1 4 重组表达质粒的构建参照#分子克隆∃的方法进行.首先利用高保真pfu Taq酶扩增成熟激肽释放酶基因片段,PCR产物酶切处理后,低熔点琼脂糖或者柱回收成熟KK基因片段.回收产物和经过酶切的载体片段用T4DNA 连接酶连接,将连接产物转化E.coli XL1 blue,提取质粒后筛选克隆、酶切鉴定.1 5 表达载体测序分析将筛选出的重组质粒由上海生物工程公司用Sanger双脱氧法测序分析.1 6 激肽释放酶融合蛋白的表达参照Nova gen公司的操作指南进行.重组质粒分别转化对照菌株E.coli B L21,表达宿主菌B L21(DE3)、B L21(DE3)plysS和HMS174(DE3)感受态细胞,次日挑取单菌落于37%振摇培养过夜后,更换新鲜培养基再培养至A600=0 6~1 0,加IPTG诱导表达.1 7 表达菌体的裂解及包涵体的提取表达菌体,加溶菌酶及Triton X 100,振荡混匀;置冰浴中超声波处理或加DNase∀室温放置至不再粘稠;4%12000r min离心15min,重悬溶菌沉淀,分别取适量溶菌悬液及其溶菌上清进行SDS PAGE.1 8 KK蛋白表达量测定参照#分子克隆∃的方法取溶菌悬液进行SDS PAGE.经考马斯亮蓝R250染色,脱色后,用凝胶图象分析仪分析,计算蛋白的相对含量.1 9 表达产物的SDS PAGE及蛋白印迹(Western blot)分析参照#分子克隆∃的方法进行.蛋白电泳后利用半干转膜系统转膜(20V,20min),牛血清白蛋白封闭过夜.次日用TB ST洗膜后分别与抗人血清激肽释放酶单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的二抗作用后显色.1 10 KK活性分析[6]使用高渗、低渗冲击法处理诱导后菌体,采用国际药学联合会(FIP)推荐、中国药品生物制品检定所改进的电位滴定法[6]检测重组人胰激肽释放酶活力.2 结果2 1 重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建见Fig. 1.2 2 重组表达质粒的酶切鉴定分别使用Pvu!和Eco R∀、Xho∀进行酶切鉴定,质粒p28b含有3个酶切位点,应产生片段93 bp、999bp、4277bp;质粒p28bmk含有4个酶切位点,应产生片段93bp、999bp、1671bp、3309bp;结果切出片段大小正确(Fig.2A.).质粒p20bmk含有Pvu!2个酶切位点,应产生片断978bp,3441bp; Eco R∀、Xho∀酶切应产生737bp,3682bp的片段.如Fig.2B.2 3 重组表达质粒的测序分析测序结果表明,重组质粒中插入基因片段为成熟激肽释放酶基因片段.313第3期李体远等:人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达Fig.1 Constructi on of the reco mbinant pl as mid p28bmKp20bmKFig.2 Restric tion analysis of reco mbinant plas mids(A) 1:p28bmK di ges ted with Pvu !;2:p28b diges ted w i th Pvu !;3:100bp marker (B) 1:PCR product;2:100bp marker;3:p20bmk digested with Pv u !;4:plasmid p2Obmk;5:p20bmk di gested with Eco R ∀+Xho ∀2 4 SDS PAGE 分析I PTG 诱导表达后,将不同菌株的菌体分别进行SDS PAGE 分析.与对照菌体相比较,重组质粒在3种表达受体菌中均高效表达了一个分子量约30kD 的蛋白质,与预计的成熟KK 融合蛋白分子量相符,推测为成熟KK 基因表达产物.其中转化pE T28b 载体的受体菌表达量较高,表达的蛋白主要存在于包涵体中.分泌型载体pET20b 表达的目的蛋白可以分泌到细胞浆中,但表达量低于pET28b(Fig.3,Fig.4).2 5 KK 融合蛋白表达量测定凝胶图象分析结果表明,KK 在受体菌B L 21314中国生物化学与分子生物学报19卷Fig.3 SDS PAGE of the expressed produc ts of p20bk in E .coil 1:Protei n marker;2:BL21(DE3)plysS induced with IPTG;3:hms174(DE3)induced with IPTG,4:BL21(DE3)induced wi th IPTG;5:BL21induced withIPTGFig.4 SDS PAGE of the expres sed products of p28bK in E .coli 1:Protei n marker;2,3:BL21(DE3)plys S i nduced with IP TG and not induced with IP TG;4,5:hms174(DE3)i nduced with IP TG and not induced with IPTG;6,7:BL21(DE3)i nduced with IP TG and not i nduced with IP TG;8,9:BL21i nduced with IPTG and not induced with IPTG(DE3)plysS 中表达量最高,pET28b 、pE T20b 载体表达的KK 融合蛋白分别占菌体总蛋白26%和10%.2 6 表达蛋白的免疫印迹分析(Western blot)以抗人血清KK 单克隆抗体为一抗,碱性磷酸酶标记的兔抗人IgG 抗体为二抗进行免疫印记分析.结果表明,诱导表达的菌体蛋白在约30kD 处均呈现强的特异性显色反应.该结果同样表明,pET28b 载体转化的受体菌表达的目的蛋白含量较高(Fig.5,6).Fig.5 Wes tern blot analysis of the expressed products of p20bK i n E .coli1:BL21;2:BL21(DE3);3:BL21(DE3)plysS;4:HMS174(DE3)Fig.6 Wes tern blot analysis of the expressed products of p28bK i n E .coli1:HMS174(DE3);2:BL21(DE3)plysS;3:BL21(DE3);4:BL212 7 KK 活性的初步分析采用猪胰腺激肽释放酶为标准品,FI P 推荐的电位滴定法对表达产物进行了初步分析,结果表明,大肠杆菌表达的激肽释放酶同样具有水解苯甲酰精胺酸乙酯(BAEE)的能力.由于没有进行纯化,并且表达产物为激肽释放酶融合蛋白,产物活性较低(小于0.1I U ml).3 讨论人组织激肽释放酶由238个氨基酸组成.在生物体内,激肽释放酶多以酶原形式存在,与其抑制剂、激肽原等一起共同组成激肽系统.对猪胰激肽释放酶的分析证明,它是由232个氨基酸残基组成的糖蛋白.B ode 等人[4]研究其氨基酸序列与人的同源性为67 4%.人组织激肽释放酶(E C 3 4 21 35)为丝氨酸蛋白酶,可以裂解低分子量的激肽原生成具有血管活性的激肽,后者参与机体一系列的生理及315第3期李体远等:人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达病理过程.激肽释放酶和激肽系统(KKS)是维持血压平衡中降压系统的一个重要组成部分,它可以调节肾脏功能,扩张毛细血管,增加血管通透性,改善微循环.同时胰激肽释放酶又是一种活化因子,能使纤维酶原激活成纤维酶,使不容性的纤维蛋白酶水解成可溶性的小肽,从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等疾病起到治疗作用,并可以治疗血栓、预防血栓再形成.胰激肽释放酶对糖尿病肾病、视网膜静脉阻塞、增加男性生殖等均有较好疗效.到目前为止,国内尚未见其他学者开展人组织激肽释放酶的高效表达研究工作.本实验构建的分泌型及非分泌型载体均高效表达了KK融合蛋白,其中pE T28载体的表达量高于pET20b.在使用的3种宿主细胞中,B L21(DE3)plysS是高效表达菌株,其表达量高于常规表达宿主BL21(DE3),与理论相符.作者曾利用pET 17(b)载体表达了HI V 1Gag及Env 蛋白,但其表达量均低于本实验.其表达量较低的原因,可能是由于(1)外源基因的起始密码子与载体的SD序列相距较大,(2)目的蛋白分子量较大(均大于50kD)所致.目的基因所含大肠杆菌稀有密码子较多则是另一可能原因.本实验中目的蛋白表达量较高,也可能受下述因素影响.第一,目的蛋白分子量大小适中,大约为30kD.许多学者认为[7],分子量处于10kD至35kD之间的表达产物可获较高的表达量,此点与本实验结果一致.第二,pE T 28(b)使用了T7lac启动子,即在T7启动子下游加入了lac操纵子序列,不存在IPTG时,该类载体能够更加严紧地调控T7RNA聚合酶的表达,使宿主免受外源蛋白的毒性的影响,但加入诱导物IPTG后,立即启动对目的蛋白的高效表达.本实验中,pE T 28(b)高效表达的KK融合蛋白主要以包涵体形式存在.SDS PAGE分析表明,目的蛋白相对含量高达26%.上清中目的蛋白的相对含量则较少(结果未显示).包涵体具有抗酸、碱,耐酶解等特点,有利于目的蛋白的稳定存在.利用包涵体密度相对较大的特点,通过离心可以对目的蛋白进行初步纯化.由于目前市场没有抗人组织激肽释放酶抗体,本实验免疫印记使用抗人血清激肽释放酶抗体为一抗,结果满意.对本实验表达的目的蛋白的生物活性进行了初步分析.结果表明,表达产物具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯(B AEE)的能力.由于检测的产物尚没有进行纯化,并且表达产物为融合蛋白,且主要存在于包含体中,因此活力较低.KK为糖基化蛋白,大肠杆菌没有翻译后修饰功能,这也是其活性较低的原因之一.作者已经开始激肽释放酶的纯化和生物功能研究工作,详细结果另文报告.作者同时构建了激肽释放酶的真核表达载体,并且进入表达阶段.重组人组织激肽释放酶的成功克隆与表达,为进一步研究激肽释放酶的生物学功能奠定基础.激肽释放酶基因工程药物的研制成功必将带来巨大的社会效益和经济效益.参考文献(References)1 Phillips M I.Gene therapy for hypertension:the preclinical data.Hype rte nsion,2001,38:543~8482 Ponder K P.Systemic gene therapy for cardi ovascular disease.TrendsCardiovasc Med,1999,9(6):158~1623 Pachori A S,Huentelman M J,Francis S C,Gelband C H,Katovich MJ,Raizada M K.The future of hypertens ion therapy:sens e,antisense, or nonsense?Hype rte nsion,2001,37:357~3644 Wol f W C,Yos hida H,Agata J,Chao L,Chao J.Human tiss uekalli krein gene delivery attenuates hypertension,renal i njury, andcardi ac remodeling i n chronic renal failure.Kidne y Int,2000,58(2):730~7395 Dellalibera Joviliano R,Reis M L,Donadi E A.Kinin s ys te m i n lupusnephritis.Int Immunopharmacol,2001,1(9 10):1889~18966 杨化新,沈佳,刘金秀.电位滴定法测定胰激肽释放酶活力测试条件探讨.药物分析杂志(Yang Hua xin,Shen Jia,Liu Jin xiu.Study on experi mental condition of pancreatic kallikrei n activity measurement using potentiomtric method.Chin J Pharmace ut Anal), 1994,14(2):10~127 李体远,戴勇,杜珙,文锦丽.中国人胰腺组织激肽释放酶基因的克隆及测序.广东医学(Li Ti yuan,Dai Yong,Du Gong,Wen J in li.Molecular cloning and sequence analysis of the human pancreatic kalli krein gene.Guangdong Me d J),2001,22(4):291~292316中国生物化学与分子生物学报19卷。