应用微卫星标记分析
应用21个微卫星标记分析山西白猪高产仔母系的遗传多样性
资助项 目： 山西省攻关 项 目（ ９ ０ ６ ２ ０ ０ １０ １ ； ９ １ １ 、０ ８ ３ １３ ） 科技 部农业科 技成果转化资金项 目（ ０ ８ Ｂ Ａ３ ０３ ） ２０ Ｇ ２ ０ ０ ２ 作者简介 ： 曹果清 （ ９ １ ， ， １７ 一）女 山西阳高人 ， 副教授 ， 博士
簇 褥 瀚 ・ ｎ ｔｓａ ｄＢｅ ｄｎ Ｇｅ ｅｉ ｎ ｒｅ ｉｇ ｃ
２ｔ年 精 拍 卷 籀 ｛期 ｏ ｏ ３
应 用 ２ 个微卫星 标记分析 １ 山西 白猪 高产仔母 系的遗传 多样性
曹果清 ， 步 高 莫 清珊 ， 李 ， 刘 宏 ｚ 薛尚军 ， 忠孝 ， 周
（ ． 西农 业 大学动物 科技 学 院 ， １山 山西太谷 ０ ００ ； ２大 同 市种猪 场 ， ３８１ ． 山西大 同 ０ ７０ ） ３ ００
关 键 词 ： 卫 星 标 记 ； 传 变异 ； 产 仔 母 系 ； 西 白猪 微 遗 高 山 中 图 分 类 号 ： ８８２ ￥２ ． 文 献 标 识 码 ：Ｂ 文 章 编 号 ： ２ ８ ７ ３ （ ０ ０ １ — ０４ ０ ０ ５ — ０ ３ ２ １ ）３ ０ １— ５
遗 传多 样性 是生 物长 期积 累 的宝贵 财 富 ，是 生
性好 ， 比性 强 ， 可 且分 析技 术 易 于实 现 自动 化 ， 认 被 为是 评价畜 禽遗 传多 样性 的最佳 选择 『 １ １ 内、 。国 外许
的 １５ｍＬ离心 管 中 ， 回实 验室 ，７ ℃保存 备用 。 ． 带 一０
１ ． 方法 ２
１ ． Ｄ Ａ的 提取 采 用 常 规 的 酚一 仿 抽 提 法提 ．１ ２ Ｎ 氯
微卫星分析讲解
3核苷酸重复有10种类型。
每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成， 其核心序列呈串联重复排列，侧翼 序列位于核心序 列的两端，为保守的特异单拷贝序列。
PCR扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测，如放 射性同位素、银染、荧光标记。
我们使用的 T1 载体是 3000bb，太长的片段不易连接。
6、接头连接里面的接头是商业化接头还是贵公司设计合成的，依据是 是我们自己制备的。同问题 3，根据内切酶所切还是互补序列 一样。
沸煮
8、 解链 15lPCR 产物。 98℃沸煮 5-10min， 迅速冰浴 1 min， 48℃水浴 1-5min，迅速冰浴 1 min。这个步骤是否有问题，每步的目的是？
已知序列：先用SSR hunter扫描SSR位点， 再根据得到的序列设计引物进行后列设计引物 进行后续实验。
实验报告主要内容
文字性实验报告：包含实验试剂耗材、步骤、实验条件、 体系、引物序列、统计结果等；
各位点筛选多态性的PDF图；
2、引物设计合成及筛选
荧光引物标记：选取一对引物中的一条，合成寡核苷 酸链后在5’端合成上荧光素，FAM、HEX、TMR、ROX 标准组合；
设计与合成：荧光引物的标记效率和纯度对后期试验 至关重要，我们按照法医身份鉴定试剂盒和基因诊断 领域的标准来制备荧光引物；
筛选：我们利用M13（荧光/通用引物，18bp，在5’端 添加荧光标记，将M13互补序列添加到一条普通引物 的5’ ）加尾法提供筛选服务
测序原始数据（序列和峰图均去掉载体序列）；
PDF图及对应的excel表（微卫星分析）；
利用微卫星标记分析巢湖鸭群体的遗传多样性
的 建议 。
关 键 词 ： 湖 鸭 ； 卫 星 ； 传 多 样 性 ； 种 巢 微 遗 保
中 图 分 类 号 ：１ ８ Ｓ ８ 文献 标 识 码 ： Ａ
ｐｈｉｍ ｎｆ ｍａ ｉ ｏ ｅ ｔ（ Ｃ）ａ ｓ ａ ｉｔｃ ｒ ａ ｃ ｌ ｔ ｄ． ｓ ｉ ｏｒ ｔｏｎ ｃ ｎｔ ｎ ＰＩ ｎｄ Ｆ— ｔ ｔｓ ｉｓ ｗｅ ｅ ｃ ｌ ｕ ａ ｅ Ｔｈｅ ｒ ｓ ｌｓ ｓ ｏｗｅ ｈａ ｏ ａ ｆ １ ｅ ｕｔ ｈ ｄ ｔ ｔ ａ ｔ ｔ ｌｏ １ １
４ Ｖｏ１２８ Ｎ Ｏ． ．
Ａ ｕ ２Ｏ ０ ｇ． １
文章 编号 ： ０ ７ ７ ８ （ ０ ０）４ ０ ２ — ５ １ ０ －用 微 卫 星 标 记 分 析 巢 湖 鸭群 体 的 遗 传 多样 性
赵 东伟 汤青 萍 李 慧 芳 陈 宽 维 陈 荣 久。 马 月辉 。 ， ， ， ， ，
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔｈ ａ ｈ ｕ ｋ ｉ ａ ｕ ｇ — ａ ｒ ｅ ｔ ｄ ｕ ｂ ｄ ｙ ｅ ｉ ｉ ａ Ｇｅ ｅ ｉ ｉ ｅ ｓｔ ｓ ｒ ｃ ： ｅ Ｃｈ ｏ ｕ ｄ ｃ ｓ ａ ｆ ｍｏ ｓ ｅ ｇ ｍｅ ｔｂ ｅ ｄ ｗｉ ｍｅ ｉ ｍ— ｏ ｙ ｔ ｐ ｎ Ｃｈ ｎ ． ｎ ｔｃ ｄ ｖ ｒ ｉ ｈ ｙ
湖 鸭 的 外 貌 特 征 、 产 特 性 和适 宜分 布 的 生 态 环境 ， 用 ２ 生 采 ６个 多 态 性 较 好 的 微 卫 星 标 记 ， 测 了 巢 湖 鸭 的 遗 传 多 检 样 性 。结 果 表 明 ：６个 微卫 星位 点 均 表 现 出 多 态 性 ， 共 检 测 到 ｌ１个 等 位 基 因 ， 均 等 位 基 因 数 为 ４ ２ ９个 ； ２ 总 １ 平 ．６ 群 体多态信息含量为 ０５６杂合度为 ０６０ ．２， ． １ 。瓶 颈 效 应 分 析 结 果 表 明 ： 群 体 已 偏 离 了 突 变一 移 平 衡 ， 期 可 能 经 该 漂 近
利用微卫星标记分析长毛兔遗传多态性及其与产毛量相关性
一
实验 与研 究 一
表 １ ４对 微 卫 星 引 物信 息
中国养兔杂 ６２６ １ 志 ／０ ９ ０
图 １ Ｓｔ 卫 星 座 位 的 部 分 扩 增 结 果 ａ ４微
１ ３ 统 计 方 法 。
１ ３ １ 基 因杂合 度 （ ｔｒｚｇｓ ｖ Ｈ） 。 ． Ｈｅ ｏｙ ｏｉ ， ｅ ｔ
（ １江 苏省畜牧兽医总站， 江苏南京 ２ ０３ ） １０６
（ 扬 州大学动物科 学与技术学院， ２ 江苏扬州 ２５０ ） ２０９
（ 安徽省农业科学院畜牧兽 医研 究所 ， ３ 安徽合肥 ２ ０３ ） ３０ １
摘
要 利用微卫星标记技 术， 分析 了皖系长毛兔的遗传 多样性和 ４个微卫星座位与 １ 岁时产毛
按照文献 方法提取基因组 Ｄ Ａ Ｎ 。试验所采用 的４ 对微卫星引物由上海生工生物工程技术公司合 成， 引物序列见表 １ 。 Ｐ Ｒ反应体积为 ２ ， Ｃ ５ 其中： 模板 ５ — ０ ｎ、 ０ １０ｇ
１ ０×ｂ ｆ ｒ２ ５ 、 ｄ Ｔ ０ １ ｌ Ｌ、 ２ ｒｔ ｏ — ｕ ｆ ． Ｌ ｅ Ｎ Ｐ ２ ０ｘ ｍｏ ／ ５ ｏ ｌ Ｍｇ ｅ
现，鸡 １ 号染色体上可能存在控制鸡体重的 Ｑ Ｌ ； Ｔｓ 周群兰等 １ 报道 ， ６ １ 位于 ８ 号和 ３ 号染色体上的 ３ 对
微卫星座位 Ａ Ｌ７ 、 Ｅ ６和 Ｍ Ｗ２２与鹿苑鸡 Ｄ ２８ Ｌ Ｉ １ ６ Ｃ ２ ｌ 周龄体重呈 著相关 ； ２ 邵根宝等 研究发现 ， 猪 １ 号染色体上部分微卫星座位与苏太猪肉质性状 ３ 存在显著相关 ； 明星等隅 储 报道 ， ６ 有 个微卫星座位
不显著 （ ＞ ． ５ 。 Ｐ ０ ０ ）
关键词 皖 系长毛 兔 ； 微卫 星（ ｉｒｓｔｌｔ Ｄ Ａ Ｒ — Ｎ Ｍ ｃｏａ ｌｅ Ｎ ｅ ｅｉ
应用微卫星DNA标记对福建亚种猕猴遗传多样性的分析
应用微卫星DNA标记对福建亚种猕猴遗传多样性的分析周建华;李志雄;杨燕燕;谢金东;俞春英;王训立【期刊名称】《实验动物与比较医学》【年(卷),期】2017(037)006【摘要】目的研究福建亚种猕猴的遗传多样性水平,为猕猴遗传质量监测方法提供基础资料.方法采用20个微卫星DNA(SSR)标记技术,经基因组DNA提取、PCR 扩增、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等,对28只福建亚种猕猴遗传多样性进行分析,用POPGENE 1.32等软件统计分析.结果福建亚种猕猴20个微卫星位点共检测到等位基因200个,观察等位基因数(Na)为10.0000±3.1119;有效等位基因数(Ne)为6.8438±2.4905;期望杂合度(He)为0.8509±0.0564;观察杂合度(Ho)为0.4607±0.1247;香隆信息指数(Ⅰ)为2.0166±0.3463;多态信息含量(PIC)为0.8154±0.0665;显示检测的20个微卫星DNA位点均存在高度的遗传多态性,其中有17个位点偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01).结论有效地分析了福建亚种猕猴群体的遗传多态性,为今后建立福建亚种猕猴遗传质量监测方法提供理论依据.%Objective To analyze the genetic diversity ofMacaca mulatta littoralis and providing basic data for genetic quality monitoring methods of the population.Methods Twenty-eight Macaca mulatta littoralis were genotyped by using 20 microsatellite DNA markers,DNA was extracted from blood and amplified by PCR,and PCR products were analyzed by non-modified polyacrylamide gel electrophoresis.Every microsatellite locus was calculated by software POPGENE 1.32 and Excel.Results All 20 microsatellite loci were highly polymorphic,200 alleles were found in thepopulation.The number of alleles (Na),effective number of alleles (Ne),expected heterozygosity (He),observed heterozygosity (Ho),Sharnon's information index (Ⅰ) and polymorphism in formation content (PIC) were ranged from 5 to 16,3.7333 to 11.6148,0.7455 to 0.9305,0.3214 to0.7500,1.3998 to 2.5963,and 0.6862 to 0.9074,with an average of10,6.8438,0.8509,0.4607,2.0166 and 0.8154,respectively.All of 17 loci showed significant deviations from Hardy-Weinbergequilibrium.Conclusions There are high genetic diversity in Macaca mulatta littoralis of this colony.The experiments can provide a theoretical foundation for establishing genetic quality monitoring method with specific microsatellite loci.【总页数】8页(P434-441)【作者】周建华;李志雄;杨燕燕;谢金东;俞春英;王训立【作者单位】福建中医药大学实验动物中心,福州350122;福建省计划生育科学技术研究所,福州350011;福建中医药大学实验动物中心,福州350122;福建中医药大学实验动物中心,福州350122;福建中医药大学实验动物中心,福州350122;福建中医药大学实验动物中心,福州350122【正文语种】中文【中图分类】Q95-33【相关文献】1.应用微卫星DNA标记进行边鸡群体遗传多样性分析 [J], 白文林;尹荣焕;杨桂芹;赵素君;宫艳秋;罗光彬2.基于微卫星DNA标记分析福建猕猴与河南猕猴的遗传多样性 [J], 周建华;李志雄;杨燕燕;谢金东;俞春英;林玮;刘德强;王训立3.微卫星DNA标记遗传多样性在家畜遗传育种上应用的研究进展 [J], 张娜娜;王清义;王玉琴;王占彬4.大口黑鲈北方亚种、佛罗里达亚种及“优鲈3号”杂交F1子代生长性能及遗传多样性分析 [J], 王佩佩;周国勤;陈树桥;陆健5.微卫星DNA标记及其在鱼类遗传多样性研究中的应用 [J], 闫华超;司振书;李桂兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
STR SSR 微卫星分析
STR/SSR/微卫星分析背景介绍微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列（STR）或简单重复序列（SSR）, 是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列。
微卫星位点通常通过PCR扩增和电泳检测, 并根据片段大小分离等位基因进行分析；扩增后的等位微卫星可以用多种方法检测, 传统方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳加放射显影或银染的方法, 费时费力效率低。
阅微基因基于5年的经验, 利用ABI遗传分析仪对荧光标记的DNA片段进行检测, 结合分子量内标进行DNA片段长度计算, 使STR分型变得高效快捷, 结果也更加精确。
服务项目１. SSR引物开发通过富集微卫星序列, 开发出20-30条具有一定重复特征的微卫星序列, 并且对序列进行多态性和特异性验证。
２.引物筛选选取部分代表性样本, 利用普通引物进行PCR扩增, 然后利用高分辨率芯片电泳或PAGE验证引物的特异性、扩增效率和基因座多态性等信息（图1）。
图1.用岛津MultiNA芯片电泳仪进行引物筛选的结果３．样本批量扩增用带有荧光标记（FAM／HEX／TMR／ROX等）的引物, 对批量样本进行PCR扩增。
我公司拥有高通量PCR仪平台, 可以满足大量样本扩增需求。
４．测序仪检测带有荧光标记的PCR产物进行稀释后与分子量内标混合, 用3730xl等测序仪进行毛细管电泳, 并得到原始数据（fsa文件, 见图2）。
图2.应用3730xl测序仪检测得到的原始图谱５. 原始数据分析编制panel和bin等文件, 使用正版GeneMapper v4.0软件分析测序仪得到的fsa文件, 并生成PDF图谱和Excel文档（包括size、基因分型等信息）, 分析后的电泳图谱见图3。
图3.GeneMapper软件分析后的电泳图谱６. 群体遗传学分析利用生物信息学软件（POPGENE、MEGA.PHYLIP、ARLEQUIN等）对上述数据进行进一步分析, 绘制遗传连锁图谱、分析连锁不平衡和分析多态性等。
应用微卫星标DNA记对三个封闭群兔遗传分析
应用微卫星标DNA记对三个封闭群兔遗传分析申幸娇，岳秉飞（中国食品药品检定研究院北京100050）[摘要]：目的检测国内日本大耳白兔、青紫蓝兔、新西兰白兔的遗传背景及遗传结构，为封闭群兔遗传检测方法建立和标准化提供基础资料。
方法应用18个微卫星标记及荧光标记-半自动基因分型技术对三个群体95个个体进行Hardy-Weinberg检测，统计每个位点等位基因频率、杂合度、F值、遗传距离等信息。
结果三个种群平均等位基因观测数为3.167、4.556、3.444，平均观测杂合度为0.444、0.5230、0.4976。
18个位点平均多态信息含量（PIC）为0.410、0.549、0.470，日本大耳白兔6个位点HWE检验P﹤0.05，显著偏离Hardy-Weinberg 平衡，并在Sat13，INRCCDDV0088位点基因型完全纯和，新西兰白兔和青紫蓝兔分别有2个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。
三个种群遗传距离：青紫蓝兔与新西兰白兔遗传距离最近，为0.124，与日本大耳白兔遗传关系最远，为0.320；新西兰白兔与日本大耳白兔较远，为0.310。
结论三个种群有各自不同遗传特征，遗传多样性较高，种群间分化明显。
个别位点偏离遗传平衡，推测人工繁育过程中存在一定问题。
[关键词]：日本大耳白兔；青紫蓝兔；新西兰白兔；封闭群；微卫星Genetic Analysis of Three Groups of Closed Clolony Rabbitsusing Microsatellite DNA MarkersSHEN Xing-jiao, YUE Bing-fei(National Institutes for Food and Drug Control Beijing 100050)[Abstract] Objective To analyze the population genetics of three groups of closed colony rabbits：Japanese white rabbits(JWR)，Chinchilla rabbits(CR)，and New Zealand rabbits(NZWR)．Methods 18 microsatellite loci were selected and tested by Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)，and the values of the allele frequency，observed heterozygosity and expected heterozygosity，the F-statistic value and the genetic distance were counted. Resualts In three populations, the average number of observed alleles respectively are 3.167、4.556、3.444;The average observed heterozygosity respectively are 0.444、0.5230、0.4976;The average polymorphism information content(PIC) respectively are 0.410、0.549、0.470. Four loci showed evident deviation from that of the HWE(P<0.05) and two loci of Sat13 and INRCCDDV0088 are基金项目：“国家科技支撑计划”项目编号2011BAI15B01；2013BAK11B01作者简介：申幸娇（1987—），女，硕士研究生，E-mail: xjshen816@通讯作者：岳秉飞，研究方向：实验动物遗传学，E-mail: yue-bingfei@completely homozygous in JWR population; There are two loci evident deviation from HWE in CR and NZW. The genetic distance of CR and NZW is 0.124, while that of CR and JWR being 0.320 and JWR and CR being 0.310. Conclusions Three populations have different genetic characteristics, whose genetic diversity are relatively rich. Several loci are evident deviation from that of the HWE, which probably indicates that certain problems exist in the process of artificial breeding.[key words] Japanese white rabbit; Chinchilla rabbit; New Zealand rabbit; closed colony animal; Microsatellite DNA家兔是最早用于实验的动物之一，在医学科学研究领域里发挥独特的作用。
应用微卫星标记分析4个黄颡鱼群体的遗传多样性
中图分 类号：Ｑ ５ ９３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （ ０２ ０ —０４ — ４ １０ ３２ ２ １ ） ４ ０ １ ０
黄颡 鱼 （ ｓｕｏａ ｒｓ ｕ ｉ ａｏ 属 鲇形 目鳞 科 黄颡 鱼 Ｐ ｅｄ ｂｇｕ ｆ ｌｄ ｃ ） ｖｒ 属， 俗称嘎牙、 黄姑子 ， 是我 国常见的一种 中小型经济鱼类 ， 广
ＴＫ Ｒ Ａ Ａ Ａ公 司的 Ｐ ＲＴ ｅｍ ｌ ｙｌｒ ｉ ， Ｃ ｈｒ ａ Ｃ ｃ ｃ 上海天能科技 ｅＤ ｅ
有限公 司 的 Ｔ ｎｎ２０ ａｏ ５ ０凝胶 成像 系统 ， 国 Ｈ ｒ ｕ 公 司 的 德 ｅａ ｓ ｅ
Ｐｍ ｉ ｒ ｏＲ高速 冷冻离心 机。ＴｑＤ Ａ酶 、Ｎ Ｐ Ｄ Ａ Ｍａ ｅ、 ａ Ｎ ｄＴ 、Ｎ ｒ ｒ ｋ
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湖南农业大学毕业论文应用微卫星标记分析湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系****：**年级专业：2009级动物医学指导教师及职称：学院：继续教育学院湖南·长沙提交日期：湖南农业大学成人高等教育本科生毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的本科毕业论文是本人在指导老师的指导下，进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体在文中均作了明确的说明并表示了谢意。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
毕业论文作者签名：年月日目录摘要 (1)关键词 (1)一、前言 (1)二、材料与方法 (2)（一）材料 (2)（二）方法....................................................................................2-3 三、结果 (4)（一）牛样本DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (4)（二）湘西黄牛各杂交牛的遗传多样性分析 (4)（三）遗传距离分析 (4)四、分析与讨论 (5)（一）湘西黄牛各杂交牛的特有等位基因和缺失的等位基因 (5)（二）杂合度、期望杂合度、观测杂合度和多态信息含量 (6)参考文献 (6)致谢词 (6)应用微卫星标记分析湘西黄牛与其他黄牛品种的亲缘关系学生：陈东指导老师：（湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）摘要：为了分析湘西黄牛与国内外其他品种的亲缘关系，本研究利用8个微卫星标记对湘西黄牛进行了遗传多样性分析。
结果发现湘西黄牛等位基因丰富，在57-72个之间；平均多态信息含量在0.8547～0.9024之间，为高度多态性；平均杂合度在0.8867～0.9248之间；各杂交牛之间都存在一些特有等位基因和缺失等位基因；通过Nei’s聚类分析，其与引进种公牛的遗传距离较大，与国内4个优良肉牛品种相比，可以单独聚为一类。
关键词：湘西黄牛；微卫星；亲缘关系；遗传距离一、前言进入20世纪70年代以来，随着DNA重组技术的产生以及分子生物学、分子遗传学等学科的迅猛发展，人类已经能够从分子水平上对遗传物质 DNA的结构进行更直接、更精确的研究，并建立了一系列的分子遗传标记 ( Molecular Genetic Markers )技术。
由于微卫星 DNA标记具有多态性高，呈共显性遗传，能准确判别等位基因，遍布于整个基因组且分布均匀等特点，在畜禽遗传育种工作中被广泛应用于构建基因图谱[1-4]，制作DNA指纹图谱[5-7]，定位功能基因和数量性状座位(QTL)[8]，进行血缘鉴定和血缘控制[9-10]，遗传多样性评估等研究。
汤青萍等[11]利用微卫星标记对中国部分地方鸡种的遗传多样性进行了分析、Reed等利用微卫星座位对家鸡和火鸡的遗传结构进行了对比分析[12]、牛荣等利用35个微卫星座位对版纳小耳猪近交系进行了遗传分析[13]、张亚平等对大熊猫微卫星DNA的筛选及应用进行了研究[14]。
湘西黄牛是湖南省地方家畜优良品种，为了能更有效地对地方品种开展合理保护、开发和利用，本研究采用微卫星 DNA标记对湘西黄牛与国内外的8个其他黄牛品种的遗传多样性进行研究，以期为相关工作提供必要的遗传学依据。
二、材料与方法（一）材料1.实验材料采集湘西黄牛的杂一代牛作为实验样本，采样地点分别在永顺县（152头）和新晃县（245头）两个地方，其中利本杂104头，西本杂88头，安本杂127头，夏本杂78头。
湘西黄牛DNA样品来自于湖南省畜牧研究所库存，利木赞、西门塔尔、安格斯以及夏洛来牛样品来自于湖南省畜牧研究所种公牛站提供的冻精。
鲁西牛、秦川牛、晋南牛、南阳牛和延边牛DNA样品及数据来自西北农林科技大学。
2.试剂全血基因组提取试剂盒购自上海生工；DNA回收试剂盒、PCR试剂购自天为时代；引物合成为上海英骏生物技术有限公司。
3.仪器梯度PCR仪（Eppendorf）、琼脂糖凝胶电泳系统（六一仪器厂）、聚丙烯酰胺凝胶电泳系统（六一仪器厂）、凝胶成像系统(TANON)、低温高速离心机（Eppendorf）、常规试剂均为分析纯等级。
（二）方法1.微卫星座位的选择通过Genebank[http:/genome/cattle/cattle.html]选择与黄牛日增重及部分经济性状相关的、多态性丰富的微卫星标记对样品DNA进行扩增，合成的微卫星引物序列见表1。
表1 微卫星引物座位、引物序列、退火温度及登录号Table1 Microsatellite loci,primer sequences,anneal temperature and genebank accession 座位正向引物反向引物退火温度登录号IDVGA44 IDVGA27 IDVGA-2 IDVGA-46 IDVGA-11 ETH3 ETH225 BM1824 TGGTCAGTCACAGAGAAGCACAGTGGTCAGTCACAGAGAAGCACAGGTAGACAAGGAAGCCGCTGAGGAAATCCTTTCAAGTATGTTTTCACCTTCTGGCAACCACCTATTTGGAACCTGCCTCTCCTGCATTGGGATCACCTTGCCACTATTTCCTGAGCAAGGTGTTTTTCCAATCGAAAGCCTGGACTCATGGAATAGAAAGCCTGGTACTCATGGAATAGAGAAAAGCCAAGAGCCAGACCACTCACTCCAGTATTCTTGTCTGCCACCTAAGTGTCTCCTGATGGAACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGGACATGACAGCCAGCTGCTACTCATTCTCCAACTGCTTCCTTG6360565758616056X85095X85046Z27071X85062Z27077Z22744Z14043G183942.样本DNA的提取选择湘西黄牛与国外引进纯种公牛杂交所产生的F1代牛作样品，从牛颈静脉或耳静脉采血，采集血液样品用ACD抗凝（ACD:血液＝6:1），用全血基因组提取试剂盒提取样本总DNA，DNA于－20℃下保存备用。
3.PCR 反应和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR 反应体系为20μL：其中含10×Buffer 2μL；10 μmol/L 引物1μL；2mmol/mLdNTP 1μL；50ng/μL DNA 模板1 μL；2U TaqDNA 聚合酶，补水至20 μL。
PCR 反应程序:95℃预变性5 min ；95℃变性30 s ，退火45 s （各微卫星引物退火温度不同，退火温度见表1）,72℃延伸30 s ，35 个循环，72℃延伸8 min 。
PCR 扩增产物在2.5％琼脂糖凝胶电泳，电压为5V/cm ，电泳后在凝胶成像系统中检验扩增结果，凡没有杂带的产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.数据统计与分析（1）等位基因频率N ii = （N ii 为具有纯合子a i a i 基因型的个体数，n ij 为具有杂合子a i a j 基因型的个体数，N 为个体总数。
）（2）基因杂合度 ∑=-=n i iq h 121 ∑==r j j r h H 1/（其中，r 为检测的位点数，n 为等位基因数，q i 为第r 个位点第i 个等位基因的频率）（3）多态信息含量（PIC ） )2()(11221112∑∑∑+=-==--=n i j j i n i n i i q q q PIC（其中q i 、q j 为等位基因频率，n 为等位基因数）（4）有效等位基因数（p i 为等位基因的频率） （5）遗传距离Ne i’s 标准遗传距离法 Ds ＝－ln （Jxy/JxJy ）（6）聚类分析根据Saitou 和Nei 提出的Neighbor-joining 方法进行聚类分析。
三、结果（一）牛样本DNA 的聚丙烯酰胺凝胶电泳通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并用硝酸银染色，对8对微卫星引物扩增湘西黄牛杂一代基因组DNA 的部份结果如图1。
图1 部分个体在微卫星IDVGA27座位上的扩增结果)()2/()2(1,11j i N n n q n i j i ij n i ii i ≠+=∑∑+=== ∑==in i i p Ne 12/1Fig1 A portion of PCR results of IDVGA27Marker: PUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ）（二）湘西黄牛各杂交牛的遗传多样性分析通过8对微卫星引物西本杂、利本杂、安本杂、夏本杂进行了等位基因检测，其中西本杂检测到69个等位基因、利本杂检测到72个等位基因、安本杂检测到67个等位基因、夏本杂检测到57个等位基因。
（三）遗传距离分析通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法测定了从西北农林科技大学提供的南阳牛、秦川牛、延边牛及郏县牛DNA样品和湖南省畜牧研究所提供的西门塔尔牛、利木赞牛、安格斯牛、夏洛来牛样品，计算出它们的等位基因数和等位基因频率，根据基因频率计算出湘西黄牛与这几个肉牛品种间的Nei’s遗传距离。
依据品种间遗传距离进行聚类分析，结果见表2和图2。
表2 湘西黄牛与国内外优良肉牛品种间Nei’s遗传距离Table2 Nei’s genetin distance between Xiangxi-yellow cattle and other breed01 02 03 04 05 06 07 080102 0.283203 0.2138 0.106604 0.2944 0.0849 0.097305 0.3026 0.1238 0.1208 0.096806 0.4132 0.4463 0.3842 0.3346 0.324707 0.3839 0.3734 0.3891 0.3545 0.3639 0.184208 0.3240 0.3021 0.3040 0.2894 0.2471 0.2435 0.231409 0.4037 0.3577 0.3249 0.3747 0.2842 0.2034 0.1942 0.1067注：01 湘西黄牛； 02 南阳牛； 03 秦川牛； 04 延边牛； 05 郏县牛； 06 西门塔尔牛；07利木赞牛； 08 安格斯牛； 09 夏洛来牛通过表2可以看出，湘西黄牛跟南阳牛、秦川牛、延边牛及郏县牛之间遗传距离都比较大，因此需将湘西黄牛单独规为一类，南阳牛和郏县红牛之间以及秦川牛和延边牛之间遗传距离都较小，可以分别聚为两类；而这些国内黄牛与国外肉牛西门塔尔牛、利木赞牛、安格斯牛以及夏洛来牛的遗传距离都比较大，在国外品种中，西门塔尔跟夏洛来牛遗传距离较小，可以跟利木赞牛一起聚为一类，安格斯牛跟这些牛相比遗传距离相对较大，可单独聚为一类。