微卫星DNA标记
SSR标记的原理
简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)1.简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。
2.SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多态性。
3.SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。
显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。
如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
4.SSR的分类根据SSR核心序列排列方式的不同，可分为3种类型：完全型(perfect)。
指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的DNA。
如：ATATATATATATATATATATATATATATATATAT不完全型(imperfect)。
指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3 。
如：ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATA T复合型(compound) 。
指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5 。
如：ATATATATATATATGGGATATATATATATA 3种类型中完全型是SSR标记中应用较多的一种类型。
微卫星DNA标记在家畜遗传育种上的研究现状
１微 卫星 Ｄ Ａ标记 Ｎ
微 卫星 是 构 建 完 整 基 因 组 连 锁 图时 使 异是 非 常 有 效 的 。 紧密 相 关 的 物 种 中 ， 在 微
随 着分子克隆 、 ＤＮＡ重组 技 术 在 分 子 用 的 主 要 基 因 标 记 。 进 行 基 因组 图谱 建 卫 星 位 点 具 有 位 置 保 守 性 ， 使 得 我 们 能 在 这 生 物 学 领 域 的 不 断 完 善 ， 之 另一 类 重 要 立 过 程 中 ， 记 的 基 因 位 点 一 般有 两类 ： 加 标 一 在 相 关 畜 种 间 如 牛 、 羊 、 绵 山羊 间 使 用跨 物
在 使 用 微 卫 星 方 法 之 前 ， 何 获 得 所 时 ， 如 仅涉 及 Ｄ ＮＡ结构 ， 常 与 表 现 型 无 关 。 通
需要 的微 卫星位 点？ 致有 三条途 径 ： 大 第 用 这种 方法 可 以 将 群 体 中 存 在 的所 有等 位 标 记进 行快 速 、 敏 的 遗传 分 析 。 且 在 目 灵 而
摘 要： 本文综述 了 卫星Ｄ Ａ 为遗传 标记 在动物遗传 育种上研 究进展 ， 微 Ｎ 作 阐明 了微 卫星标记是一种非 常理 想的分子标记技术 ， 具有广 阔的应 用前景 。 同时对今 后微 卫星ＤＮＡ标记在 动物遗传 育种 中的研究工作提 出 了自己的一些 见解 。 关 键词 ： 卫星Ｄ 动物遗传 育种 研 究现状 微 ＮＡ 中 图分类号 ： ８ Ｓ Ｉ ３ 文献标 识 码 ： Ａ 文章 编号 ： ４ ０ ８ （ Ｏ ０ （） ０ ２ ０ １ ７ — ９ Ｘ Ｚ １ ）２ ｃ一 １ － １ ６ ２ ３
一
、
寻 找 已存 在 的 微 卫 星 引 物 ； 二 、 用 基 因 无 一 遗 漏 地 鉴 定 出来 。 家 畜 中用 分 前 的 应 用 中仍 然 存 在 一 些 不 足 如 ： 卫 星 第 使 在 微 子 遗 传 学基 因技 术 研 究 发 现 的 遗 传 缺 陷 多 的获得较为繁琐 、 分析成本 大及ＰＣ Ｒ扩增 产 物 在 检测 过 程 中 ， 现 的 基 因带 重 叠 ， 出 很 难 判 断 等位 基 因 ， 成 研 究结 果 不 准 确 ， 造 因
SSR标记的原理步骤
SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。
研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。
如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。
由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
? 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。
因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。
但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。
动物dna鉴定
动物DNA 鉴定是一种通过分析动物DNA 来确定动物身份、亲缘关系或遗传特征的技术。
以下是一些常见的动物DNA 鉴定方法：
1.基因分型：通过对特定基因座上的等位基因进行分析，以确定个
体的基因型。
这种方法常用于动物的亲子鉴定、品种鉴定和遗传
疾病的检测。
2.DNA 指纹图谱：通过对特定DNA 片段的长度和序列进行分析，
以产生独特的DNA 图谱。
这种方法常用于动物的个体识别、品
种鉴定和遗传多样性的研究。
3.微卫星标记：微卫星是一种短的DNA 序列，在基因组中分布广
泛且具有高度多态性。
通过对微卫星标记的分析，可以进行亲子
鉴定、品种鉴定和遗传连锁分析。
4.线粒体DNA 分析：线粒体DNA 是独立于核基因组的DNA 分
子，具有较高的进化速率和母系遗传特征。
通过对线粒体DNA 的分析，可以进行物种鉴定、亲缘关系分析和母系遗传的研究。
这些方法通常需要采集动物的血液、毛发、唾液或其他组织样本，并使用适当的DNA 提取和分析技术进行处理。
动物DNA 鉴定在动物保护、野生动物管理、宠物身份确认、动物遗传育种等领域具有广泛的应用。
微卫星DNA标记技术的特点及其在动物研究中的应用
基 因 的重 复单 位 数 目是 高 度 变
同 ． 此 微卫 星显 示 了高 度 多 态 性 因 通 过 对 微 卫 星 Ｄ Ａ 态 性 的 研 究 可 在 生 Ｎ 多 产 中选 取 数 个 与 生 产 性 能 相 连 锁 的微 卫 星标 记 。在 这 些 位 点 上 对 所 研 究 的 品 种 或 品 系进 行 分 析 ．计 算 父 本 与母
１２ 微 卫 星 ＤＮ 数 量 多 且 在 基 因组 ． Ａ
尔遗传规律 ．能够稳定地从上一代传
位 点 多态 性 ． 些 特 点 可 以 帮 助 我 们 这 进 行 做 各 种 遗 传 分 析 ．而 且 在 这 些 微 卫 星位 点 中多 数 可 以 为 不 同 动 物 所 共
１１ 微 卫星 标 记 具 有 丰 富 的 多态 性 ． 微 卫 星 结 构 中 各 位 点 上 不 同 等 位
增 发 现 ：在 羊 中５ ％ 的引 物 可 扩 增 出 ６
特 异产 物 ．其 中４ ％ 的扩 增 产 物 表 现 ２
多 态 ．而 在 马和 人 中则 未 扩 增 出多 态
用。 目前 ． 卫 星 标记 技术 已经 被 广 泛 微 运 用 于 遗 传 图谱 的 构 建 、品 系 间 的 遗
物 ． 过 Ｐ Ｒ 增 ． 后 再 通 过 凝 胶 电 通 Ｃ 扩 然
（ 春 学 院 生命 科 学 与资 源 环 境 学 院 ， 西 宜 春 宜 江
中图 分 类 号 ：８５ ￥ １
文献 标 识 码 ： Ｂ
文章 编 号 ：０ ８ ｏ １（ｏ １— ０ ４ ０ １０ 一 ４ ４２ ｌ）２ ０３ — ２ １
关于遗传标记 str 和snp
Target region
(short tandem repeat)
The FBI has selected 13 core STR loci that must be run in all DNA tests in order to provide a common currency with DNA profiles
The polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify STR regions and label the amplicons with fluorescent dyes using locus-specific primers
8 repeats
IMPACT OF DNA AMOUNT INTO PCR
Reason that DNA Quantitation is Important Prior to Multiplex Amplification
通常 0.5 – 2.0 ng DNA 的模板 对于试剂盒来说是最合适的
Too much DNA
NULL ALLELES
解决办法：关键在于引物设计！！！
MUTATION RATES
极少数情况下会出现，子代的某个位点的分 型与父母其中一方的分型不匹配的情况，可 能来自于染色体行为 通常是多一个或者少一个重复单位 突变率大约为千分之一 在可变的STRs中，突变率会相对更高
微卫星 DNA 标记是解决亲子鉴定的有效手段
微卫星DNA与亲子鉴定一. 微卫星DNA：重复单位序列最短，只有2～6bp，串联成簇，长度50～100bp，又称为短串联重复序列（Short Tandem Repeat STR)。
广泛分布于基因组中。
其中富含A-T碱基对，是在研究DNA 多态性标记过程中发现的。
1981年Miesfeld等首次发现微卫星DNA，其重复单位长度一般为1～6个核苷酸，双核苷酸重复单位常为(CA)n和(TG)n。
二．亲子鉴定：根据鉴定目的的不同，DNA亲子鉴定可以分为司法鉴定和个人鉴定。
司法鉴定，是指在诉讼活动中鉴定人运用科学技术或者专门知识对诉讼涉及的专门性问题进行鉴别和判断并提供鉴定意见的活动，是我国主要的法律鉴定制度。
三．微卫星DNA 标记是解决亲子鉴定的有效手段, 无论家畜, 还是野生动物或人工圈养小群体, 象马匹、奶牛、肉牛、东北虎、绵羊、鳄鱼等动物都有学者成功解决了亲子关系的确认。
Ellegr en 等用5 个马科的微卫星座位( 要求有 6 个以上的多态性座位) 判定马的亲权关系可使排除率达98% 以上, 10个位点排除率达99. 99% 。
Binns 等用 6 个微卫星位点解决了20 匹以前用血型无法判定的纯血马的亲权归属, Lee 和Choi 应用14 对马科微卫星引物对纯种马进行鉴定, 结果支持微卫星标记在亲子鉴定中的潜力, 排除率为99. 98% 。
Sherm an 等[使用微卫星座位评价肉牛公牛数量和公牛间亲缘关系对后代的影响, 并计算非父排除率和不明父亲的概率。
贾名威等用 6 个微卫星座位判清了几头奶牛的嫌疑父亲, 还使用这 6 对引物为法院做过亲子鉴定, 破案后确与事实吻合。
Mo mmens 等用微卫星引物作了大量的亲子鉴定研究, 同时也指出微卫星是作为遗传距离计算和分子系统发生树构建的理想标记。
张于光等用 6 对家猫和 4 对苏门答腊虎共 10 对引物鉴定了7 个父子关系不清的东北虎后代。
对于绵羊的嫌疑父亲确认也是一样的有效与准确Fitzsim mons 等( 2002) 用微卫星 DNA 标记结合mtDNA 对暹罗鳄、古巴鳄及湾鳄 103 只个体进行研究, 成功鉴定出 4 个个体为种间杂交后代, 其中 2 个最初的形态鉴定有误, 而有 1 个险些作为纯种暹罗鳄野外放养, 有效地避免了种间杂交个体对野外群体中暹罗鳄种质资源的影响。
微卫星DNA又叫简单重复序列
微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。
如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展起了SSR标记。
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。
由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。
由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。
由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
RAPD 技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。
其以基因组DNA为模板, 以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物, 在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增。
扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。
扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。
其实都是基于序列的多态性分析分子技术，只不过针对对象和最终目的不同。
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1微卫星DNA标记的发现
1974年，Skinner等在研究寄居蟹的基因组时发现了微
卫星DNA的重复序列。
此后，在人、动物和酵母的基因组中都发现了类似大量的简单重复序列。
直到1986年，Ail等首次用合成的微卫星寡核苷酸作为探针用于人的指纹分析，这时才得到重视。
1988年，Jeffreys等人做了进一步的研究并使之发展成为新的遗传分子标记系统。
1989年，Litt等[1]扩增到了人类基因组微卫星序列，从而创造了“微卫星（microsatellite）”这个名称。
2微卫星DNA的结构
微卫星DNA又称简单重复序列(simplesequencere-peats，SSR)或短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)，是指以少数几个核苷酸（一般是1~6个）为单位串联重复的DNA序列。
这些重复序列的重复次数和重复程度在不同的生物体内高度变化，并且随机分布于真核生物基因组中。
普遍认为，在染色体上，除着丝粒及端粒区域外，其他区域也广泛散在分布有微卫星位点。
Weber根据微卫星核心序列排列方式的不同，将其分为完全（无间隔）、不完全（有非重复单位的碱基间隔）和复合型（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）微卫星3种类型。
3微卫星DNA标记的优缺点
3.1优点
①分布广泛。
微卫星DNA广泛且均匀地分布于真核生物基因组中。
②多态性丰富。
由于微卫星在不同个体中的重复单位数目变异大，因而造成其长度具有高度的多态性，使其可以包含大量丰富的信息。
③简易高效安全性。
微卫星检测方法简便且效率高，单个位点检测时间很短，一般不超过24h，并可以多个位点同时进行检测。
微卫星标记没有任何表型效应，因而不存在对家畜个体的有害或次级效应。
④保守与通用性。
微卫星侧翼序列的保守性以及物种间某些染色体区段的共线性，某一物种的微卫星引物可以应用于相近物种。
⑤共显性遗传。
微卫星标记的等位基因遵循孟德尔共显性遗传，因而易区分纯合型和杂合型。
3.2缺点
①建立和筛选基因文库，进行克隆和测序，都是非常繁琐、耗时的工作。
②由于不同物种的微卫星侧翼序列不尽相同，因此针对不同物种设计相应的特异性引物也非常耗时。
③微卫星进化具有复杂性，可能出现同源异型或异源同型。
④PCR 扩增受许多因素的影响，使一些等位基因无法被扩增出来，即“无效基因”。
影响亲子鉴定的正确性。
⑤目前还没有发现哪个DNA探针能很好地匹配他们各自的多态性
4微卫星DNA的筛选方法
获得微卫星DNA的常规方法主要有两种:①通过构建基因组文库,核心重复序列探针标记,杂交筛选,测序及特异引物设计等一系列步骤;②可利用近缘物种间某些染色体片段的同源关系,以已知的微卫星DNA引物作跨物种使用,从中筛选出适宜于另一物种的微卫星DNA标记.
5微卫星DNA的筛选步骤:
①基因组文库的构建,提取基因组DNA,酶切后与载体连接,将连接产物转入大肠杆菌,涂板后在37℃下培养,用α-互补法筛选阳性的重组质粒;②质粒DNA的提取;
③转膜、杂交、测序,质粒DNA变性后转到尼龙膜或硝酸纤维素膜上,用标记好的探针和膜上的重组质粒DNA杂交,检测后挑选信号强的阳性质粒测序,根据测序结果,选择合适的微卫星序列作为分子标记
6微卫星DNA的检测
微卫星DNA是一类用途十分广泛的DNA分子标记,其寡核苷酸的重复次数在同一物种不同基因型的个体之间差异很大而呈现高度多态性,其多态性可用PCR 技术结合电泳被检测出来,即将微卫星DNA特异地定位于染色体的某一位置,然后用与两侧保守的DNA序列互补的方式,设计出特定的寡核苷酸引物对基因组DNA 进行PCR扩增,然后将扩增产物在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶上进行电泳加以分离,从而检测出DNA的多态性,即检测出了不同个体在每个微卫星座位上遗传结构的差别.常用检测方法有简单序列长度多态性检测法、荧光标记PCR 法等.此外微卫星侧翼区扩增技术、单链构象多态性(SSCP))技术等都可用于对微卫星DNA的检测
7微卫星DNA标记技术的相关问题
目前，微卫星DNA标记技术仍存在着一些问题，如微卫星DNA技术获得过程复杂、繁琐、费时；对由非损伤样法获得的样品进行检测仍存在一定困难；微卫星DNA标记技术中，由于使用引物的不同，有时会导致所得试验结果的差异较大；无效等位基因的出现，也会给微卫星DNA标记技术的应用带来困难。
同时，尽管微卫星DNA标记技术已有广泛的应用，然而仍有很多相关问题还在研究和探索中，例如微卫星的功能，导致动态突变或三核苷酸重复序列不稳定性和扩展的分子机理，动态突变的致病机理等等
8微卫星在水产上应用
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