微卫星分子标记开发操作指引
微卫星分子标记开发操作指南
1、250ng DNA酶切（DNA必须比较纯）
反应体系：ddH20 17.25µL
10X buffer R 2.5µL
MseⅠ(10U/ µL ) 0.25uL（ 2.5U）
DNA(50ng/µL) 5µL
总反应体系25µL , PCR仪 内37℃ ,3h酶切,65℃，15分钟失活。电泳检测：1.5%的琼脂糖，150V 电泳20min，点样量约9µL-10µL，剩余的15µL用于连接。
2、酶切后的产物连接。
反应体系： ddH20 8.8µL
MseⅠ接头 1uM (3µL) 即1pmol/µL
0.405nmol/μl = 405 pmol/μl
T4 buffer 3µL
T4 DNA ligase(5U/ µL ) 0.2µL(1u)
酶切后DNA 15 µL
总反应体系30µL , PCR仪 内37℃ ,2h或21℃，过夜连接，65℃10min失活。
MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/ 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’
接头：10µL 100pmol/µL+90µLddH2O=100µL 10pmol/µL
3、连接的产物用灭菌蒸馏水稀释10倍（10µL酶切产物+90µL水）
4、稀释的连接产物预扩增。
反应体系： 无菌水 9.6µL
Taq DNA聚合酶 buffer 1 X 2µL
MgCl2 1.5mM 2µL
MseⅠ-N primer 120ng 1µL
dNTPs 200uM 0.2µL
Taq DNA聚合酶 0.4U 0.2µL
稀释的连接产物 5 µL 5µL
总反应体系20µL。
反应条件为： 94℃ 30s， 53℃ 60s，72℃ 60s，14-26个循环（循环数需优化14-17-20-23-26）
MseⅠ-N 引物为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’，N表示包括所有4种可能的选择碱基N=A，T，C，G,1.5%琼脂糖电泳检测
5、最佳反应条件下，PCR重新扩增一次，获得几百ng的扩增产物，试剂盒纯化。
6、杂交 * 5’端生物素化的探针的选择：常见的几种探针： （AC）15，（CT）15，（GA）15，（CAA）10，（AAG）8，（GATA）7，（ACCT）6
*250 ng -500 ng扩增的DNA与50-80 pmol 的生物素化的探针混合，加入总体积100 µL的SSC X4.2和SDS 0.07%中（即 21µL SSC X10加0.7 µL SDS 10%，加水至100 µL）。2 µg的DNA与200pmol 的探针在终体积500µL终浓度0.5 X SSC 溶液中，60℃杂交2小时。
* 95℃ 3min变性，室温，15min退火
7、富集
纯化的带接头的DNA（2-2.5微克）约30-50µL，95℃变性5分钟，与3’端生物素化的（CA）10或（GA）10 或5’生物素化探针（60℃杂交2h）200pmol（1µL）在50℃ 0.5倍SSC杂交1.5h,加入600µL的磁珠重悬于100µL的0.5 X SSC 溶液中，室温，20分钟。
300µL的预热至50℃的0.1 X SSC 溶液洗2次
300µL的0.1 X SSC 溶液室温洗2次
DNA洗脱至100µL的预热至50℃的双蒸水中，2次
试剂盒操作说明：
轻弹管底，使磁珠重悬，用磁场吸附磁珠,小心去上清（不能离心!!）
用300µL的0.5 X SSC 溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清(重复2次)
重悬于100µL的0.5 X SSC,加入DNA探针混合物
室温温育10分钟，每1-2分钟，倒置管子混匀
吸附磁珠，去上清
300µL的0.1 X SSC 溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清。重复3次，最后一次去上清尽量去干净（洗完后的上清保留以便查找实验故障的原因）
重悬于100µL的水中，轻弹管底是磁珠重悬
磁场吸附磁珠，上清液（我们需要的产物）转移至灭菌的管子中，保留磁珠。加入150µL的水，重复洗脱一遍，共得到250µL的产物
富集
* 1mg 的磁珠用TEN100（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH
7.5）冲洗，重悬于40 µL的TEN100 中。
* 加入10 µL（约1 u g）的不相关的PCR产物（为了尽量减少非特异性结合的DNA）
* DNA-探针混合物用300 µL的TEN100稀释
* 稀释的DNA-探针混合物加入洗好的磁珠，室温温育30min，温育过程中不时温和搅拌(Incubate on rotator, or sideways in orbital
shaker on slow speed at 50 for 30 min.)
* 15000转，离心1min，（以便查找失败原因）
*非严格冲洗： 加入400µL的TEN1000（（10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA,
1M NaCl, pH 7.5）, 室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。
*严格冲洗： 加入400µL的SSC 0.2 X，0.1% SDS，室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。
8、加入50 µL TE （10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0），95℃ 温育5min，上清（里面包含我们需要的DNA）迅速转移并保存。
9、磁珠中再加入12µL的0.15 M的NaOH，加入适量的0.1167 M的醋酸（醋酸量事先用滴定法标定），最后加入TE 至总体积50 µL，95℃ 温育5min，保存。
10、所得DNA 加入10%体积的3M的乙酸钠，混匀。再加入1体积的-20℃预冷的异丙醇，室温过夜沉淀或-20℃沉淀30分钟，再用50 µL 灭菌蒸馏水溶解。
0.8%的琼脂糖电泳检测，DNA点样量2µL ，123bp Marker 3µL ,140v ，30分钟。理想的为弥散，否则考虑重做。
11、9、10所得的DNA分别PCR 扩增：
反应体系：Taq DNA聚合酶 buffer 1 X
MgCl2 1.5mM MseⅠ-N primer 120ng
dNTPs 200uM
Taq DNA聚合酶 0.4U
DNA 溶液 5 µL
总反应体系20µL。
反应条件为： 94℃ 30s， 53℃ 60s，72℃ 60s，30个循环
琼脂糖检测扩增产物，4中引物均应该产生大于200 bp 的弥散带（即最后一次严格冲洗后的上清液PCR扩增理想的结果是没有任何产物，表明非特异结合的DNA完全去除掉了）。
12 PCR产物的纯化，使用试剂盒，按说明书操作
13、利用TA cloning 克隆PCR扩增子，得到重组克隆，按说明书操作
14、转入感受态细胞。
* 从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑选一个单菌落，转到一个含有100 ml的LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约3小时（旋转摇床，300转/分）。
* 在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次使用的、用水冰浴的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃
* 于4℃用Sorvall GS3转头以4000转/分，离心10ml，以回收细胞。一般情况每管装25毫升。注：离心一定要平衡！
* 倒出培养液，将管倒置1分钟，以使最后残留的培养液流尽。
* 每管用5 ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，用灭菌的剪口的枪头轻柔搅动底部沉淀，并缓慢反复吸打几次使之混匀，放置于冰浴上10分钟。[用Mille-Q 级纯水配置的1M CaCl2 贮存液，以10 ml小份贮存于-20℃。制备感受台细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100ml（超净工作台上专用100 ml量筒现用现配），用0.45µm孔径的滤膜过滤除菌，然后骤冷到0℃即可。]
*于4℃用Sorvall GS3转头以8000转/分，离心6ml，以回收细胞。注：离心一定要平衡！ * 倒出培养液，将管倒置1分钟，以使最后残留的培养液流尽。
* 每50ml 初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，用灭菌的剪口的枪头轻柔搅动底部沉淀，并缓慢反复吸打几次使之混匀。
* 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200µL转移到无菌的微量离心管中。（若不马上进行转化，该感受态细胞可加入终浓度为20%的灭菌甘油，置于-70℃冻存。）每管中加连接产物10µL（体积〈10µL，DNA〈50 ng〉，轻轻旋转以混匀内容无，在冰上放置30分钟，（实验中设置阳性和阴性对照）
* 将管放到预先加温到42℃的循环水浴锅中放好的使馆架上，恰恰放90秒，不要摇动试管。
分子标记介绍
分⼦标记介绍
分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA
⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。它能够直接反映基因
组间DNA间的差异。常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。RAPD、AFLP属于以PCR为基础的
分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础
的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍
1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）
RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。所以对于引起酶切位点变异的
突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。此⽅法的基本步骤包括：DNA的
提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。探针⼀般选择单拷贝的。其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。⽤该技
术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种
的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，
通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱
带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、
⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)
微卫星 DNA 标记是解决亲子鉴定的有效手段
微卫星DNA与亲子鉴定
一. 微卫星DNA：
重复单位序列最短，只有2～6bp，串联成簇，长度50～100bp，又称为短串联重复序列（Short Tandem Repeat STR)。广泛分布于基因组中。 其中富含A-T碱基对，是在研究DNA多态性标记过程中发现的。1981年Miesfeld等首次发现微卫星DNA，其重复单位长度一般为1～6个核苷酸，双核苷酸重复单位常为(CA)n和(TG)n。
二．亲子鉴定：
根据鉴定目的的不同，DNA亲子鉴定可以分为司法鉴定和个人鉴定。司法鉴定，是指在诉讼活动中鉴定人运用科学技术或者专门知识对诉讼涉及的专门性问题进行鉴别和判断并提供鉴定意见的活动，是我国主要的法律鉴定制度。
三． 微卫星 DNA 标记是解决亲子鉴定的有效手段, 无论家畜, 还是野生动物或人工圈养小群体, 象马匹、奶牛、肉牛、东北虎、绵羊、鳄鱼等动物都有学者 成功解决了亲子关系的确认。Ellegr en 等用 5 个 马科的微卫星座位( 要求有 6 个以上的多态性座位) 判定马的亲权关系可使排除率达 98% 以上, 10个位点排除率达 99. 99% 。Binns 等用 6
个微卫星位 点解决了 20 匹以前用血型无法判定的纯血马的亲 权归属, Lee 和 Choi 应用 14 对马科微卫星引物对纯种马进行鉴定, 结果支持微卫星标记在亲子鉴定中的潜力,
排除率为 99. 98% 。Sherm an 等[使用 微卫星座位评价肉牛公牛数量和公牛间亲缘关系对 后代的影响, 并计算非父排除率和不明父亲的概率。 贾名威等用 6 个微卫星座位判清了几头奶牛的嫌 疑父亲, 还使用这 6 对引物为法院做过亲子鉴定, 破 案后确与事实吻合。Mo mmens 等用微卫星引物 作了大量的亲子鉴定研究, 同时也指出微卫星是作
为遗传距离计算和分子系统发生树构建的理想标 记。张于光等用 6 对家猫和 4 对苏门答腊虎共 10 对引物鉴定了
SSR技术原理,方法及步骤课件.doc
精品文摘 SSR技术
1. SSR 简介
说明：简单重复序列 (Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序 (SSR)也称微卫星 DNA ，
其串联重复的核心序列为 1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复， 即(CA) n 和(TG) n 每个微卫
星 DNA 的核心序列结构相同，重复单位数目 10-60 个，其高度多态性主要来源于串联数目
的不同。
SSR标记的基本原理 ：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过 PCR 反应扩增微
卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同， 因而能够用 PCR 的方法扩增出不同长度的 PCR
产物， 将扩增产物进行凝胶电泳， 根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 在
真核生物中，存在许多 2-5bp 简单重复序列，称为 “微卫星 DNA” 其两端的序列高度保守，
可设计双引物进行 PCR 扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点 ：(l) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点； (2)微卫星呈共
显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子； (3)所需 DNA 量少。显然，在采用 SSR 技术分析微
卫星 DNA 多态性时必须知道重复序列两端的 DNA 序列的信息。 如不能直接从 DNA 数据库
查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类 ：根据 SSR 核心序列排列方式的不同， 可分为 3 种类型：1）完全型 (perfect) ，
指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的 DNA 。如：
ATATATATATATATATATATATATATATATATAT ；2）不完全型 (imperfect) ，指在 SSR 的
核心序列之间有 3 个以下的非重复碱基 ,但两端的连续重复核心序列重复数大于 3 。如：
ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT ；3） 复
合型(compound) ，指 2 个或 2 个以上的串联核心序列由 3 个或 3 个以上的连续的非重复碱
微卫星引物筛选步骤
1．进行酶切
用VspⅠ对四种鱼（GC、GS、NL和ZZ）基因组DNA（需基因组DNA浓度较高）进行酶切。
反应体系为：ddH2O 15µL
VspⅠbuffer 2µL
VspⅠ酶 1µL
DNA 2µL
总体积 20µL
酶切在37℃反应3～4h即可，但是为了提高酶切效率可切4～6h。
PCR反应程序为：94℃ 5min，（94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min）×30，72℃ 10min，4℃ hold。
VspⅠ酶即（AseⅠ酶）：酶切识别位点为：5’A T↓T A A T 3’
5’T A A T↑T A 3’
AseⅠ酶的接头为：
A1：5’CTC GTA GAC TGC GTA CC 3’
A2：5’TAG GTA CGC AGT C 3’
AseⅠ酶用的预扩增产物为：
A3：5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT 3’
2．接头制备
用10µL A1（200µM）和10µL A2（200µM）混合，94℃ 3min后室温放置30min。
3．酶切片段与接头连接
接头为A1和A2制备的接头，命名为AE。连接反应体系如下：
ddH2O 5µL
T4 ligation酶 0.5µL
T4 buffer 4µL
酶切产物 20µL
微卫星标记
鳗及其近交后代微卫星分子标记研究
RAPD指纹方面的初步研究，但采用微卫星分子标记进行分析的研究还相对较少。
而微卫星分子标记方法在动植物育种上己经作为一种育种辅助标记广泛应用。
2遗传标记的发展及应用
遗传标记 (GelleticMarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离可
以明确反映遗传多态性的生物特征，是基因型特殊的可识别的表现形式，它是生物
分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。广义的遗
传标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的遗传标记概念只是指
DNA分子标记(Parke:。tal.，1998)。理想的遗传标记一般必须达到以下几个要求:
(1)具有高度的多态性;(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合
和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位
点的标记外，要求分子标记的位点均匀分布于整个基因组;(6)选择中性，即无基
因多效性;(7)检测片段简单、快速，实验程序易自动化;(8)开发成本和使用
成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好，便于数据交换。但是，目前
发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求(贾继增，1996;邱芳等，1998;
赵淑清等，2000)。遗传标记已作为一种辅助育种标记广泛应用于动、植物及其它领
域。从不同层次水平上看，它可分为形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标
记四种
2.1形态学标记
形态学标记(MO甲 hologicalmarkers)是指那些从表型上看显示遗传多态性的特
征，即生物特征，如鱼的体高、体长、体色等。由于形态学标记易观察、识别，因
此它一直是选种、育种的重要标记，也是孟德尔遗传学创立的重要基础。由自发突
变或物理化学诱变均可获得具有特定优良性状的形态特征，通过人工选育工作使那
些优良胜状稳定遗传下来，从而达到选育的目的和效果，自上个世纪80年代，我国
ISSR分子标记法
1、基因组DNA的提取，这个可以用试剂盒或者是传统的CTAB法，提取后的DNA经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观测提取DNA的质量
2、选取ISSR引物，并请生物公司合成
3、利用合成的引物，和自己提取的DNA，进行PCR扩增
4、ISSR最关键的便是PCR的扩增过程，在此过程中还要进行体系的优化、退火温度的筛选等，如果这些都可以了，便已经完成了整个实验的99%
5、进行数据的分析
ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。其基本原理是:用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4个随机核昔酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。
ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性;与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。目前，ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。
ISSR标记
ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。
微卫星标记技术原理
微卫星标记技术原理
微卫星标记技术是一种基于PCR (Polymerase Chain Reaction)
扩增的分子标记技术。微卫星是基因组中较短、高度可变重复序列（Simple Sequence Repeats, SSRs），在不同个体或同一基因组中的不同位置均有差异。微卫星标记技术通过引物对位于微卫星序列的两端的flanking序列进行PCR扩增，再以电泳方法进行分离和检测。
具体步骤包括：1. DNA提取，取得待检测组织的DNA；2. 引物设计，设计与微卫星重复序列两侧的flanking序列可以特异性结合的引物；3. PCR扩增，将待检测的DNA模板按设定条件进行PCR扩增；4.
电泳分离，将扩增产物以电泳方式分离出来；5. 图谱显示和分析，通过显示分离出来的电泳带，分析出样品间和亲缘关系的差异以及基因型信息。
微卫星标记技术具有高度多态性、重复性好、易于检测、特异性强等优点。它已广泛应用于动植物的遗传多样性、种间亲缘关系研究、基因定位及遗传距离测定等方面。
EST-SSSR分子标记的建立
课程名称： 分子育种学 指导老师： 崔海瑞 成绩：
实验名称： EST-SSR标记的开发 实验类型： 综合型
分工： 谢奕-EST获取+结果分析+引物设计 王鹏潮-SSR筛选+SSR统计+结果分析
一、实验目的和要求
1、了解SSR标记的开发策略；
2、明确EST-SSR标记的特点和建立EST-SSR标记的原理；
3、熟悉EST-SSR标记的过程，掌握EST-SSR标记的开发技术。
二、实验内容和原理
1、实验内容
通过从现有的EST文库中获取序列，再用软件对其进行SSR查找与引物设计。
2、实验原理
1）微卫星DNA
真核基因组中存在着大量的串联重复序列, 按重复单位的大小, 串联重复可分为卫星（重复序列>70bp）、小卫星（6～70bp）和微卫星DNA（1-6bp）。
微卫星（Microsatellite, MS）是指基因组中以少数几个核苷酸（多数为2～4个）为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列，又称简单序列重复（Simple Sequence
Repeats , SSR）或短串联重复（Short Tandem Repeats , STR）、或简单序列长度多态性（Simple Sequence Length Polymorphism，SSLP）。
重复数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保守序列，所以通过设计引物进行PCR 扩增，就可以检测到不同的DNA 区域重复数目的多态性。
2）SSR标记的开发策略
SSR包括基因组SSR（genomic SSR或gSSR）和表达区EST-SSR（genic-SSR或EST-SSR）。gSSR是基于基因组序列开发的，开发起来费时费力，而且因为探针的缘故，种类比较局限。而EST—SSR则是存在于表达的基因序列内的SSR，不包括内含子及非表达的调控区等之中的SSR，通常三个碱基重复的占多数，与不引起基因翻译过程中移码现象的发生相一致。
苹果品种鉴定技术规程 ssr分子标记法全文
苹果品种鉴定技术规程 ssr分子标记法全文
苹果品种鉴定技术规程—— SSR分子标记法
一、技术原理
SSR（Simple Sequence Repeats）分子标记法是一种常用的遗传标记技术，也称为微卫星标记法。该技术基于植物DNA中包含的重复序列，通过PCR扩增特定的SSR位点，进而对DNA序列进行分析，从而实现对苹果品种的鉴定。
二、实验步骤
1. DNA提取：从苹果叶片或幼芽中提取基因组DNA。
2. SSR扩增反应：选择特定的SSR引物对DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物。
3. PCR产物分析：将PCR产品通过电泳方法分离在聚丙烯酰胺凝胶上，通过比较DNA片段迁移距离，鉴定不同苹果品种之间的差异。
三、实验材料 1.离心管和PCR试管：用于提取DNA和进行PCR反应。
2. DNA提取试剂盒：用于提取DNA样品。
3. SSR引物组合：根据需要选择适宜的SSR引物。
4. PCR试剂盒：用于PCR反应。
5. DNA电泳试剂盒：用于DNA样品分离。
四、实验操作细节
1. DNA提取：按照DNA提取试剂盒的说明进行操作，提取苹果叶片或幼芽中的基因组DNA。
2. SSR扩增反应：准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。根据引物选择，设置合适数量的PCR反应管。
3. PCR条件设置：根据引物的特性，设置适当的扩增温度和周期。
4. PCR产物分析：将PCR反应产物通过电泳方法分离在聚丙烯酰胺凝胶上，根据DNA片段大小进行鉴定。
5.结果解读：根据电泳图像，比较不同苹果品种之间的DNA条带差异，判断品种间的差异和相似性。 五、结果分析
1. SSR分离电泳图像：根据电泳分离的结果，分析苹果品种之间的遗传关系和差异。
2. SSR结构鉴定：通过比对已知品种的SSR位点，来反推未知品种的SSR结构和遗传关系。
3. SSR图谱构建：通过整理分析的SSR位点数据，构建苹果品种的SSR图谱，进一步研究苹果品种的遗传表达规律。
微卫星分子标记开发方法
微卫星分子标记开发操作指南
1、250ng DNA酶切（DNA必须比较纯）
反应体系：ddH20 17.25µL
10X buffer R 2.5µL
MseⅠ(10U/ µL ) 0.25uL（ 2.5U）
DNA(50ng/µL) 5µL
总反应体系25µL , PCR仪 内37℃ ,3h酶切,65℃，15分钟失活。电泳检测：1.5%的琼脂糖，150V 电泳20min，点样量约9µL-10µL，剩余的15µL用于连接。
2、酶切后的产物连接。
反应体系： ddH20 8.8µL
MseⅠ接头 1uM (3µL) 即1pmol/µL
0.405nmol/μl = 405 pmol/μl
T4 buffer 3µL
T4 DNA ligase(5U/ µL ) 0.2µL(1u)
酶切后DNA 15 µL
总反应体系30µL , PCR仪 内37℃ ,2h或21℃，过夜连接，65℃10min失活。
MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/ 5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’
接头：10µL 100pmol/µL+90µLddH2O=100µL 10pmol/µL
3、连接的产物用灭菌蒸馏水稀释10倍（10µL酶切产物+90µL水）
4、稀释的连接产物预扩增。
反应体系： 无菌水 9.6µL