虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选

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实验1-虎纹蛙微卫星序列引物的开发

虎纹蛙基因组SSR标记的开发研究背景：简单序列重复（simple sequence repeats，SSRs）又称微卫星（microsatellites）标记具有共显性、高多态性、多等位性、稳定性好以及操作简单等诸多优点，作为理想的分子标记已广泛应用到人类、许多动物、植物的遗传学研究。

SSR 标记的开发有多种方法，包括传统的构建基因组文库、利用各种富集方法、基于ISSR-PCR 的方法、利用FIASCO 方法分离、借用近缘物种的标记以及较为简单的利用DNA 序列信息开发SSR 标记。

大量基因组和生物信息学资源不断产生，为快速开发生物SSR标记提供了机会。

虎纹蛙是中大型蛙科（Ranidae）动物，列入国家二级保护动物名录，国内主要见于长江以南地区的低海拔稻田、水塘和沟渠等地。

受人为捕捉、环境污染和生境破坏等影响，虎纹蛙野外数量已锐减，开展该种的基础研究显得尤为迫切。

此外泰国虎纹蛙大量引入和人工饲养，更是造成本地虎纹蛙种群数量的衰退。

本实验从虎纹蛙全基因组序列中发掘多态性SSRs，旨在为本地虎纹蛙物种的鉴定、遗传变异、系统进化、高密度分子作图和功能基因鉴定与克隆等研究提供丰富和更加有效SSR 标记。

研究方法：1.全基因组测序选取1个雄性虎纹蛙个体，取肌肉组织，进行DNA提取，并由北京诺和生物信息技术公司完成全基因组测序，DNA测序量（12G）约为总DNA量的10%。

2.DNA序列数据初步筛选采用SSR Hunter 1.3软件进行DNA序列数据中的SSR初筛。

重复元件的核苷酸数选为“4个”，重复次数最少为“5”。

从序列库中选取4000-10000行（每2行为1条DNA序列，包括DNA序列编号和碱基序列），粘贴于空白框内。

点击SSR 位点搜索，软件进行运算（基本数据量越大，越容易卡，导致软件显示“未响应”，（不用在意这个，其实软件一直在进行运算），一般10000行运行1-2小时不等），运算结束后，会弹出对话框，进行保存运算后的数据。

4 个斧文蛤群体微卫星标记的遗传多样性分析

å å å PIC
= 1-æççççè
n i=1
Pi2
ö÷÷÷÷ø -
n-1 i=1
n
2Pi2 Pj2
j=i+1
其中: Pi、Pj 是某个位点第 i、j 个等位基因的基因
频率, n 为该位点上的等位基因数。
2 结果与分析
2.1 斧文蛤 4 个地理群体各个位点的微卫星遗传结构分析
表 2 中给出了 13 对微卫星引物在 4 个群体中的实验分析结果。13 对引物在 4 个斧文蛤群体中分别检测到 57、45、52 和 45 个等位基因, 基于不同群体检出的等位基因不一致, 共检测出 63 个不同等位基因。其中位点 Me114 和 Me128 等位基因数最多, 均为 7 个, 表现为高度多态。图 1 和图 2 是不同位点在斧文蛤广东汕头群体中分离的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。位点 Me114 在斧文蛤广东群体中分离得到 6 个等位基因, 而位点 Me124 在斧文蛤广东群体中只分离得到 2 个等位基因。每个位点等位基因数(Na)为 2~7 个, 平均每个位点等位基因数(Na)为 4.87, 有效等位基因数 (Ne)为 1.927~2.591, 平均观测杂合度(Ho)为 0.460~0.575, 平均期望杂合度(He)为 0.469~
收稿日期: 2014-05-28; 修订日期: 2014-08-06. 基金项目: 海洋公益性行业科研专项子任务(201205021-5); 国家贝类产业技术体系项目(CARS-48). 作者简介: 滕爽爽(1983−), 女, 助理研究员, 研究方向为贝类遗传与育种. E-mail: tengjiayu925@ 通信作者: 张炯明, 高级工程师. E-mail: zjm-9630@

筛选微卫星位点的改进方法

筛选微卫星位点的改进方法谭春敏;徐永涛;周智红【期刊名称】《科技信息》【年(卷),期】2014(000)013【摘要】微卫星位点是遗传学领域被广泛使用的分子标记。

磁珠富集法筛选微卫星是一种新的方法，可以降低筛选时间以及劳动强度，大大提高微卫星位点的得率。

本文主要实验步骤包括：（1）构建小插入片段基因组文库；（2）生物素标记的探针富集；（3）阳性克隆建库；（4）进行PCR筛选。

在此路线的基础上，通过采用两次杂交富集的技术，对原有技术路线进行了方法改进。

新的方法在提高阳性克隆率上取得了成功。

【总页数】3页(P81-82,87)【作者】谭春敏;徐永涛;周智红【作者单位】青海师范大学生命与地理科学学院，青海西宁810008; 青海三江源民族中学，青海西宁810000;青海师范大学生命与地理科学学院，青海西宁810008;青海师范大学生命与地理科学学院，青海西宁810008【正文语种】中文【相关文献】1.一种筛选微卫星位点的改进方法及其在小熊猫微卫星基因文库构建上的应用 [J], 艳丽;刘志瑾;魏辅文;李明2.飘鱼微卫星位点的筛选及珠江流域5个地理群体的遗传多样性分析 [J], 阮惠婷; 徐姗楠; 李敏; 戴嘉格; 李振海; 邹柯姝; 刘丽3.基于de novo高通量测序的叶尔羌高原鳅微卫星位点筛选与多态性分析 [J], 王锦秀;宋勇;王新月;陈生熬;任道全4.绵羊(ATAG)n四碱基微卫星位点的筛选及其在亲子鉴定中的应用 [J], 胡明月;刘正喜;赵中利;曹阳;马惠海;闫守庆5.果子狸多态性微卫星位点的筛选及特性分析 [J], 王迪;张丹;熊梦吟;卜红亮;王大军;姚蒙;李晟;王戎疆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于微卫星标记的胎生蜥蜴母本与子代的遗传多样性研究

基于微卫星标记的胎生蜥蜴母本与子代的遗传多样性研究赵丹;刘玉芬;赵文阁;刘鹏【摘要】采用微卫星标记技术,对我国胎生蜥蜴(Zootoca vivipara)3个种群共18只母本和67只子代进行遗传多样性分析.结果表明,11对微卫星引物在额尔古纳、库都尔和布尔津种群检测到的等位基因数分别为70、64和68个,YW16和YW18位点的等位基因数最多,额尔古纳和库都尔种群子代的遗传多样性高于母本,而布尔津种群子代的遗传多样性与母本无显著差异,这可能与该种群的多父权比例低、窝仔数少有关,建议加大对该种群的研究和保护力度.【期刊名称】《哈尔滨师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2017(033)004【总页数】4页(P50-53)【关键词】胎生蜥蜴;微卫星;等位基因【作者】赵丹;刘玉芬;赵文阁;刘鹏【作者单位】哈尔滨师范大学;哈尔滨师范大学;哈尔滨师范大学;哈尔滨师范大学【正文语种】中文【中图分类】Q347在动物的有性生殖过程中，父本遗传信息的加入以及染色体分离和重组增强了子代的基因多样化和亲本的遗传互补，使子代产生更大的变异和新的性状，比母本具有更多的遗传多样性，从而有利于种族的繁衍和对环境的适应[1-3].目前，应用于种群遗传多样性检测、婚配制度及亲子关系分析、个体识别和物种保护等方面的分子标记较多.其中，微卫星标记技术因为具有高度的个体特异性、多态性和杂合性而被广泛使用[4,5].胎生蜥蜴(Zootoca vivipara)隶属于爬行纲有鳞目蜥蜴科，具有卵生-卵胎生双重繁殖方式，我国分布的种群均为卵胎生[6].胎生蜥蜴不同地理种群在形态大小、生活史特征及遗传结构等方面存在显著变化[7-9].因此，该文采用微卫星标记技术对我国胎生蜥蜴不同种群母本与子代之间的遗传多样性进行分析和比较，为该物种的保护和管理提供分子生物学方面的基础资料.在2012～2014年的4～5月份，采用徒手法捕捉的方式从新疆布尔津、内蒙古额尔古纳和库都尔等地采集已经交配后的雌性胎生蜥蜴，剪指标记后带回哈尔滨师范大学实验室内室温条件下( 20～25℃)饲养[10,11].当怀孕的雌性胎生蜥蜴腹部明显膨大时，将其单独饲养，直至产下幼体.繁殖结束后，额尔古纳种群6只雌体共产仔蜥25只，库都尔种群6只雌体共产仔蜥24只，布尔津种群6只雌体共产仔蜥18只，总计85只个体.取胎生蜥蜴的尾部肌肉放入无水乙醇中保存并做好标记，确保母本和子代之间能够相互对应.使用上海生工生物工程有限公司SanPrep柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，将稀释的DNA模板放在-20℃保存.在Genbank上选取11对多态性较好的微卫星引物(见表1)[12-14]，由哈尔滨博仕生物公司合成后进行PCR扩增.PCR反应体系为模板DNA1.0 μL，上下游引物各0.8 μL，10×PCR Buffer2 μL，dNTP1.6 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O13.6 μL.反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，最适退火温度30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保温.使用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(30%聚丙烯酰胺17 mL，5×TBE 10 mL，10%APS 500 μL，TEMED 50 μL，去离子水定容至50 mL)检测PCR产物.每个产物上样7 μL(含1.5 μL Buffer)，在100 V电压下进行电泳.在电泳结束后，用银染法进行染色.首先放入固定液中固定15 min，然后在双蒸水中浸泡3 min，重复3次后放入0.1% AgNO3溶液15 min，再用dd H2O洗脱3次，最后放入显色液中静置，当有条带出现后快速拿出，在蒸馏水中清洗后放入固定液中保存.使用SONY单反照相机DSC-F828对电泳结果拍照记录，电泳图片用Gel-pro analyzer 4.5软件分析，扩增片段的大小与天根生化科技有限公司的DNA Marker pBR322进行比较，将相同迁移距离的条带看作同一位点，标记为1，没有出现条带则标记为0，使用Quantity One软件分析母本和子代的基因型[15]，并统计等位基因数.应用 Popgene 1.32 软件计算观察等位基因数、有效等位基因数、Nei’s多样性指数和Shannon’s指数，利用Gervus 3.0软件计算多态信息含量.在11个微卫星位点中，额尔古纳种群中共检测到70个等位基因，其中母本有53个等位基因，子代有66个等位基因，新增17个等位基因，YW16位点的等位基因最多，母本有8个等位基因，子代有9个等位基因，总体有11个等位基因；库都尔种群中共检测到64个等位基因，其中母本有50个等位基因，子代有63个等位基因，新增14个等位基因，YW18位点的等位基因最多，母本有8个等位基因，子代有8个等位基因，总体有9个等位基因；布尔津种群中共检测到68个等位基因，其中母本有55个等位基因，子代有66个等位基因，新增13个等位基因，YW16位点的等位基因最多，母本有8个等位基因，子代有9个等位基因，总体有9个等位基因(见表2).额尔古纳、库都尔和布尔津3个胎生蜥蜴种群子代11个微卫星位点的观察等位基因数和Shannon’s指数的平均值均显著高于母本，额尔古纳和库都尔2个种群子代的有效等位基因数、多态信息含量和Nei’s多样性指数的平均值均显著高于母本，而布尔津种群子代的有效等位基因数、多态信息含量和Nei’s多样性指数的平均值和母本之间无显著差异(见表3).以往的研究表明，胎生蜥蜴雌性具有多次交配的行为，繁殖期在腹面形成多个交配痕[11,16]，并在子代中表现出多父权现象[17].雌性选择与多个雄性交配的婚配制度可以使雌性获得更多高质量的配偶，从而提高后代的适合度，使得子代比母本具有更多的遗传多样性[2].在本研究中，布尔津种群的平均窝仔数为3.00±0.89只，额尔古纳种群的平均窝仔数为4.17±1.33只，库都尔种群的平均窝仔数为4.00±1.27只，布尔津种群的平均窝仔数显著低于其他两个种群.由此推测，与额尔古纳和库都尔种群相比，布尔津种群子代新增的等位基因数少，遗传多样性也没有显著增加，可能与该种群的多父权比例低、窝仔数少有关.胎生蜥蜴是所有蜥蜴中分布最广泛的种类，从西班牙西北部向东横跨整个欧洲，一直延伸到库页岛，向北可达北纬73°，向南可达北纬41°.我国是胎生蜥蜴分布的南部边界，主要分布在新疆、内蒙古和黑龙江等地区.作为胎生蜥蜴的边缘种群，布尔津种群的数量少、分布范围小、遗传多样性水平低[6,18]，因此，应加大对该种群的研究和保护力度，探讨不同种群之间的系统发育和起源演化关系.【相关文献】[1] 张宪德. 灰文鸟配偶选择及分子机制研究[D]. 辽宁大学, 2016.[2] 管昊. 基于微卫星技术的白鹭种群遗传多样性初步研究[D]. 厦门大学, 2012.[3] 张秀梅, 张东雪, 王亮. 水生动物多次交配繁殖策略与多重父权研究进展[J]. 中国海洋大学学报：自然科学版, 2016, 46(11): 22-31.[4] 赵丹, 赵文阁, 刘鹏. 我国蜥蜴微卫星标记的开发及其应用[J]. 哈尔滨师范大学自然科学学报, 2016, 32(3): 83-86.[5] 罗丹. 基于微卫星标记的罗坑自然保护区饲养鳄蜥种群的父权关系和遗传多样性分析[D]. 广西师范大学, 2014.[6] 赵文阁, 刘鹏, 陈辉. 黑龙江省两栖动物志[M]. 北京: 科学出版社, 2008.[7] Bauwens D, Verheyen R F. Variation of reproductive traits in a population of the lizard Lacerta vivipara[J]. Holarctic Ecology, 1987, 10: 120-127.[8] Guillaume Cl P, Heulin B, Pavlinov IY, et al. Morphological variations in the common lizard, Lacerta (Zootoca) vivipara[J]. Russian Journal of Herpetology, 2006, 13:1-10.[9] Takeuchi H, Takeuchi M, Hikida T. Extremely low genetic diversity in the Japanese population of Zootoca vivipara (Squamata: Lacertidae) revealed by Mitochondrial DNA[J]. Current Herpetology, 2013, 32:66-70.[10] 宋乔蕊, 扬成, 刘鹏, 等. 人工饲养条件下胎生蜥蜴蜕皮行为的观察[J].动物学杂志, 2015, 50(3): 366-371.[11] 范玉玲, 扬成, 刘鹏, 等. 胎生蜥蜴雌性腹部交配痕的初步观察[J]. 哈尔滨师范大学自然科学学报, 2015, 31(3): 104-106.[12] Boudjemadi K, Martin O, Simon J C, et al. Development and cross-species comparison of microsatellite markers in two lizard species, Lacerta vivipara and Podarcis muralis[J]. Molecular Ecology, 1999, 8(3): 518-520.[13] Virginie M S, Murielle R, Colin B, et al. Twelve new polymorphic microsatellite loci for the common lizard, Zootoca vivipara[J]. Molecular Ecology Resources, 2011, 11: 586-589.[14] Schwartz T S, Olsson M. Microsatellite markers developed for a Swedish population of sand lizard (Lacerta agilis)[J]. Conservation Genetics, 2008, 9(3): 715-717.[15] 陈友明, 陈校辉, 潘莹, 等. 江黄颡(♀)和乌苏里拟鲿(♂)及其杂交子代遗传变异的RAPD分析[J]. 上海海洋大学学报, 2010, 19(1): 12-18.[16] 李殿伟, 刘鹏, 赵文阁. 模拟生境中胎生蜥蜴的交配行为及其与环境因子的关系[J]. 动物学杂志, 2011, 46(5): 41-47.[17] Laloi D, Richard M, Lecomte J, et al. Multiple paternity in clutches of common lizard Lacerta vivipara: data from microsatellite markers[J]. Molecular Ecology, 2004, 13(3): 719-723.[18] 刘欢. 胎生蜥蜴遗传多样性研究[D]. 哈尔滨师范大学, 2016.。

基因组微卫星DNA位点的分离方法及其在水产动物中的应用

基因组微卫星DNA位点的分离方法及其在水产动物中的应用李莉好;喻达辉
【期刊名称】《南方水产科学》
【年(卷),期】2006(002)005
【摘要】微卫星DNA是分布于基因组的1～6个碱基组成的串联重复序列,或简单序列重复.微卫星DNA具有多态性高、数量丰富、共显性遗传和分析简单等特点,应用越来越广泛,已成为最受青睐的分子标记之一.微卫星分子标记的获得首次必须从实验生物中分离.分离微卫星DNA位点的方法有多种.文章对几种微卫星DNA 位点分离技术进行介绍和分析比较,为选择合适的分离方法提供参考.
【总页数】7页(P74-80)
【作者】李莉好;喻达辉
【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;上海水产大学,上海,200090;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300
【正文语种】中文
【中图分类】Q753
【相关文献】
1.基因组学技术及其在水产动物研究中的应用综述 [J], 张思源;欧江涛;王资生;柴志欣;钟金城
2.鳞翅目昆虫基因组中微卫星DNA的特征以及对其分离的影响 [J], 吉亚杰;张德兴
3.微卫星DNA的分离方法及其在猪遗传育种中的应用 [J], 马海明;黄生强;贺长青
4.全基因组选择育种策略及在水产动物育种中的应用前景 [J], 于洋;张晓军;李富花;相建海
5.水产动物基因组近交分析软件的开发和应用 [J], 栾培贤;张晓峰;户国
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微卫星位点筛选方法综述

论文综述微卫星分子标记筛选方法综述摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(short tandem repeat, STR)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)。

它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。

本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。

最简便、最省时的方法是从从公共数据库（如Genbank、EMBL、EST数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。

第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。

关键词：微卫星；分子标记；实验动物微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（Simple Sequence Repeat , SSR），短串联重复（Short Tandem Repeat STR），是以少数几个核苷酸（一般1～6个）为重复单位的串联重复DNA序列。

微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1]，在植物基因组中平均每33 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6 Kb存在一个20 bp长的微卫星位点[2]。

并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。

微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体（或多倍体）的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD 等显性标记所无法做到的。

另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。

目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。

随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。

利用微卫星标记和线粒体mtDNA D-loop 区分析龙胜凤鸡遗传多样性

利用微卫星标记和线粒体mtDNA D-loop 区分析龙胜凤鸡遗传多样性作者：黄英飞，莫国东，吴强，孙俊丽，周志扬，万火福，韦凤英，廖玉英来源：《畜牧兽医科学》 2019年第18期黄英飞，莫国东，吴强，孙俊丽，周志扬，万火福，韦凤英，廖玉英（广西畜牧研究所，广西家畜遗传改良重点实验室，南宁 530001）摘要：试验利用微卫星标记和线粒体mtDNA D-loop区分析龙胜凤鸡的遗传多样性及其品种资源的保种效果，进而更好的保护和利用。

在龙胜凤鸡保种群中随机抽取30只血样，采用PCR和直接测序的方法测定mtDNA D-loop序列。

结果表明：18对微卫星检测中，龙胜凤鸡的多态信息含量PIC平均为0.5869，4个中度多态位点，14个高度多态位点；线粒体mtDNA D-loop区中，共发现9种单倍型，21个变异位点，变异方式主要是转换，未发现缺失；核苷酸多样度为（0.01129±0.00349），单倍型多态度为（0.5150±0.1110）；在NJ系统发生树上，分为3大类群，则具有3个血统来源，结果显示龙胜凤鸡具有比较丰富的遗传多样性和较低的变异程度，说明采用家系保种法对龙胜凤鸡进行保种，方法有效可行。

关键词：龙胜凤鸡；微卫星；线粒体；保种效果中图分类号：S828文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.0010 引言龙胜凤鸡俗称瑶山鸡，因其凤头、羽色绚丽多彩而得名，喻有凤凰之意。

具有肉质鲜美、适应性和抗病力强，耐寒耐粗饲等优点，但有个子小、生长速度慢等缺点[1]。

正是因为生长慢，龙胜凤鸡的饲养量不高，近年人为导入外来品种进行杂交改良，这给龙胜凤鸡这一优良品种带来巨大的危害，严重可导致灭绝。

因此，加强龙胜凤鸡遗传资源保护研究对其种质资源保护和开发利用具有重要意义。

微卫星标记和线粒体分析是近年研究鸡品种遗传多样性最常用的分子标记，具有多态性丰富、信息含量大、共显性和保守性等特点，已成为研究群体遗传结构和亲缘关系的有效方法之一[2-4]。

中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法[发明专利]

专利名称：中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法
专利类型：发明专利
发明人：张加勇,俞丹娜,叶丽婷,朱成成,於倍菲,王超峰,邵晨,郑荣泉
申请号：CN201310656633.3
申请日：20131206
公开号：CN103667482A
公开日：
20140326
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：为了解决中国虎纹蛙实际保护工作中对外形酷似的中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的鉴定，本发明提供一种中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法。

该鉴定方法以PCR技术为基础，设计特异性引物进行扩增，从而达到对中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的快速鉴定，具体实现步骤为：1）提取样本DNA；2）样本DNA检测；3）PCR扩增；分别采用四对特异性引物进行扩增；4）特异扩增产物鉴别。

本发明设计的四对引物涉及不同基因位置，只需通过PCR扩增即可区分中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙，引物特异性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带稳定性高，无区域性差异，在实际应用中能够获得可靠而有益的效果。

申请人：浙江师范大学
地址：321004 浙江省金华市婺城区迎宾大道688号浙江师范大学生化学院10幢114室
国籍：CN
代理机构：杭州斯可睿专利事务所有限公司
代理人：林君勇
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护野生动物，同时被列入ＣＴＳ附录二和《ＩＥ中国物种红色名录》易危等级。近年来由于栖息地破坏、Ｊ过
度捕猎以及人们传统饮食文化消费的影响，虎纹蛙野
生种群数量急剧下降。为了满足人们日益增长的消费
需求，大量泰国虎纹蛙种群被引入国内进行人工养殖，同时还与本地种群进行杂交繁育。这种繁育方式Ｊ和大规模的种群下降会对物种的遗传多样性和遗传结
文献标识码：Ａ
文章编号：６４３４２１）２０３－４１７－４Ｘ（０１０－７００
基金项目：浙江省自然科学基金项目（５６３）浙江省科技计划重点项目（０８２０７Ｙ０２４；２０１２５）２作者简介：东海（９２一）男，宁沈阳人，士研究生，究方向为两栖类保护遗传学与分子生态学。陈１８，辽硕研
因此本文采用近缘物种跨种扩增的方法对虎纹蛙
的微卫星位点进行引物筛选，以期为该物种遗传多样性和遗传结构的检测及无尾目物种跨种扩增的后续相
关研究提供基础资料。
１材料和方法
３ｓ退火温度退火３ｓ７￣延伸４ｓ最后再７￣延５，５，２Ｃ５；２Ｃ伸ｌｍｎＯｉ。其中退火温度采用温度梯度（８４￣６ ℃）Ｃ一０来执行。对于有扩增产物的位点，优化其反应条件和反应体系，直至获得单一、稳定的扩增结果。将ＰＲ扩增后的结果按照有无目的条带、Ｃ涂带和
（．１浙江师范大学生态研究所，浙江金华３１０；．２０４２浙江大学生命科学学院，杭州３０５）１０８
摘要：用近缘种中已发表的微卫星ＤＡ标记引物，利Ｎ对虎纹蛙（ｏｌａａｈｓｒｇｌｌ）Ｈｐｂｔｃｕｌｌｏｌ进行跨种ＰＲ扩增，ｏｒｌｌｓＢＣ但是获
构产生显著的影响。微卫星（ｉｓｅｉ）ｍｃａｌｔ分子标记由于具有高度的ｍｔｌｅ
司；主要仪器包括：ｐｅｄｆ５１Ｒ高速冷冻离心机；Ｅｐｎｏ７４
Ｅｐｎｏ恒温混匀仪；ｈｒｏＮ干燥仪；Ｉ — ｐｅｄｆＴｅＤＡｍＢＯＲＤ电泳仪；ＩＡＢＯ—ＲＤ梯度ＰＲ仪；ＩＡＣＢＯ—ＰＤ紫Ａ
２ｌＯ１年２月
湖北第二师范学院学报
ＪｕｎｌｏｌｉｅｓｔｆＥｕａｉｎｏｒａｆＨｕ￣ｉＵｎｖｒｉｏｄｃｔｏｙ
Ｆｂ２０．８Ｎｏ２１２．
虎纹蛙微卫星位点的跨种引物筛选
陈东海邵晨王宇２，，
Ｌｄ＇．５ｍｏＬＴｑ０７ＭＣ２采用１５：ＮＰ０１ｍｌ；ａ．５Ｕ；ｇ１：ｒ／．ｍｌＬ，．ｍｏＬ和２５ｍｍｌＬ三个浓度梯度。ｍｏ／２０ｍｌ／．ｏ／反应条件为：５预变性５ｉ；９￣Ｃｍｎ３５个循环的９ ℃变性５
得了较低的跨种扩增成功率。研究结果显示仅有１（３．％）点在虎纹蛙能够获得成功扩增，０个约３３位而其中仅有２个
（６７）点的扩增结果是没有拖带和非特异性的物种特异性扩增；．％的住点完全没有扩增产物，２％的位点约．％位４７６而０
种扩增也被认为是获得微卫星位点的方法中最为经济
的方法。
ＰＲ反应总体系为２，Ｃ５包括：模版ＤＡ８ｇＮｎ；０引物０１ａｌ；ｒ — ｃ１ｍｌ；ｃ５ｔｌ．２０ｏＬＴｉＨｌ０ｍｏＬＫｌ０ｒｏｎ／ｓ／ｅ／ｏ
对虎纹蛙基因组ＤＡ进行跨种ＰＲ扩增。微卫星引ＮＣ物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。１４跨种ＰＲ扩增及检测．Ｃ
微卫星位点左右的侧翼序列在近缘物种间是相对保守
的，因而通过近缘物种跨种扩增以获得所需物种的微卫星序列被认为是可行的。此外引用近缘物种进行跨
虎纹蛙（ｏｌａａｈｓｍｇｌｓｓ主要分布于我Ｈｐｏｌｃｕｕｏｕ）ｂｒ国南方诸省及东南亚少数国家－，１是我国国家二级保］
法提取基因组ＤＡ，解于Ｔ（．１ｏＬＴｉ— Ｎ溶Ｅ００ｍｌｒ／ｓ
Ｈｌ．ｍｌＬＥＴＰ８０中，ｃ，１ｏＤＡ，Ｈ．）利用紫外分光光度计０／测定样品浓度和纯度，保存于一０２ ℃保存备用。１２主要试剂和仪器．用于ＰＲ反应的ｄＴＳ、ａＮ聚合酶及ＣＮＰＴｑＤＡＤ２０Ｎａｅ均购自宝生物工程（Ｌ００ＤＡＭｒｒｋ大连）有限公
产物为该位点的非特异性扩增。本文认为影响爵栖纲无尾目物种跨种扩增成功率的因素除了与该类群物种的基因组大
小有关外，与两栖类物种间的亲缘关系还远近有关。
关键词：卫星；微跨种扩增；因组；基亲缘关系；虎纹蛙
中图分类号：３Ｑ４
外凝胶成像系统。１３微卫星位点的选取．
多态性、选择中性、信息含量大、呈共显性等特点，因而被广泛应用于分析种群遗传结构和遗传多样性ｌ］４，
基因流［７，６１种群进化史和物种判定等研究领域。，。
从Ｇｎａｋ和已发表的两栖类物种中选择了３ｅｂｎＯ对具有高度多态性的微卫星位点。。坫作为候选引物，