黑龙江省完达山东部林区马鹿微卫星位点的筛选

野生动物Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｍａ１　ｏｆ　Ｗｉｌｄｌｉｆｅ　２０１０，３１（２）：５９—６２　黑龙江省完达山东部林区马鹿微卫星位点的筛选　张辉张明海　（东北林业大学野生动物资源学院，　罗理扬　哈尔滨，１５００４０）　

摘要：利用黑尾鹿、白尾鹿等近缘物种的１８对微卫星引物，对２个东北马鹿肌肉ＤＮＡ样品和１７６个粪便ＤＮＡ样品　进行扩增，通过毛细管电泳法筛选适合东北马鹿的微卫星位点。结果表明，其中３个位点为高度多态性位点　（ＰＩＣ＞０．５），１个为中度多态性位点（０．５＞ＰＩＣ＞０．２５）。共检测到２６个等位基因片段，平均每个位点６．５个等位　基因。多态信息含量０．３９３～０．８２７，个体识别率０．６４３～０．９５８，累积个体识别率为０．９９９９，累积非父排除率为　０．９９７６。这４个多态性微卫星位点为东北马鹿的遗传研究提供了理论依据。　关键词：马鹿；微卫星位点：粪便ＤＮＡ　中图分类号：Ｑ７５，Ｑ９５９．８４２　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—０１２７（２０１０）０２—０５９—０５　

Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　ｉｎ　Ｗａｐｉｔｉ　ｆｒｏｍ　Ｅａｓｔｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｎｄａ　Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ　Ｚｈａｎｇ　Ｈｕｉ　Ｚｈａｎｇ　Ｍｉｎｇｈａｉ　Ｌｕｏ　Ｌｉｙａｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ｗｉｌｄｌｉｆｅ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００４０，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：１８　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｂｌａｃｋ—ｔａｉｌｅｄ　ａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　ｔａｉｌｅｄ　ｄｅｅｒ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ＤＮＡ　ｍｉｃ—　ｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｏｆ　ｍｕｓｃｌｅ　ｏｆ　２　ｗａｐｉｔｉ（Ｃｅｒｖｕｓ　ｅｌａｐｈｕｓ　ｘａｎｔｈｏｐｙｇａｓ）ａｎｄ　１７６　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｆｅｃｅｓ　ｏｆ　ｗａｐｉｔｉ．Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　３　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　１　８　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｉｎ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　１　ｗａｓ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ．２６　ａｌｌｅｌｉｃ　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ，ｗｉｔｈ　６．５　ａｌｌｅｌｅｓ　ｐｅｒ　ｌｏｃｕｓ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｒａｎｇｅ　０．３９３　ｔｏ　０．８２７，ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ　０．６４３　ｔｏ　０．９５８，ｔｏｔａｌ　ｐｏｗｅｒ　ｏｆ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　０．９９９９　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐａｔｅｒｎｉｔｙ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｗａｓ　０．９９７６．Ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　４　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ａｐｐｌｙｉｎｇ　ｔｏ　ｇｅ－　ｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　ｗａｐｉｔｉ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｗａｐｉｔｉ；Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ＤＮＡ；ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

马鹿（Ｃｅｒｖｕｓ　ｅｌａｐｈｕｓ　ｘａｎｔｈｏｐｙｇｕｓ）是我国东北地区　典型的林栖大型有蹄类动物，为国家Ⅱ级重点保护野生　动物，在阔叶红松林生态系统中发挥着重要的生态作　用　，并具有很高的经济价值。　微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ＤＮＡ），也被称为短串联重复　（ｓｈｏｒｔ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＴＲ），是指以１～６个核苷酸为基　本重复单位的串联重复序列　Ｊ，广泛存在于真核生物基　因组中，长度较短，多在４００　ｂｐ以下，易于聚合酶链式　反应（ＰＣＲ）扩增，在动物的个体识别、亲子鉴定、基　因连锁分析、群体遗传研究和遗传性疾病诊断等方面正　发挥着巨大的作用　。　为了从微卫星ＤＮＡ中得到有效的生物学信息，就必　须进行微卫星分析，多态性微卫星位点的获得是微卫星　分析的关键。对于多态性微卫星位点，不同的等位基因　表现为不同长度的扩增片段。目前已经发展出多种电泳　技术来检测等位基因大小，主要有聚丙烯酰胺凝胶电　泳、荧光标记一毛细管电泳技术等。毛细管电泳法　（ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）是近几年崛起的高效快速　的分离分析技术。此法最主要的优点是快速、微量、分　辨率高、重复性好、易于定量和自动化。毛细管电泳法　对于微卫星的分型非常稳定和精确。将多重ＰＣＲ产物在　同一根毛细管中电泳，所能容纳的位点数多达１６个。另　外，选用的分子量标准与待测样品在同一根毛细管中电　泳，更增加了片段长度测量的精确度。更有文献表明荧　光标记全自动测序技术进行微卫星分型的灵敏度高于聚　丙烯酰胺凝胶电泳　。　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８７０３０９）；黑龙江省自然科学基金重点项目（ＺＪＮ一０５０１　第一作者简介：张辉，女，２５岁，硕士研究生；主要从事野生动物分子生物学方面的研究。　通讯作者：张明海，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｍｉｎｇｈａｉ２００４＠１２６．ｅｏｍ　张辉等：黑龙江省完达山东部林区马鹿微卫星位点的筛选　２期　微卫星ＤＮＡ多态位点为马鹿等有蹄类动物的遗传结　构和多样性等研究提供了新的分子研究方法。我国鹿科　动物粪便ＤＮＡ研究刚刚起步，目前已有马鹿粪便ＤＮＡ　提取质量¨　、利用粪便ＤＮＡ鉴定马鹿性别Ｅｌ４］和种群大　小　等方面的研究，但尚未见关于东北马鹿微卫星位点　筛选的专门报道。因此，本文旨在筛选高效的马鹿多态　性微卫星位点，为马鹿的遗传多样性保护工作提供重要　的科学依据。　１材料与方法　１．１实验材料　本实验的１７６个马鹿粪便样品和２个肌肉样品均来　自黑龙江省完达山东部林区。采集粪便样品时，每堆随　机选取ｌ０粒粪球，戴一次性ＰＥ手套将其装入封口袋　中。由于正值冬季，气温一１５℃～一３０％，所以取样期　间将样品保存于室外避光环境中。带回实验室立即保存　于一２０℃冰箱中。　１．２　ＤＮＡ提取及检测　粪便样品ＤＮＡ的提取使用德国ＱＩＡＧＥＮ公司的粪便　ＤＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｓｔｏｏｌ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ）。肌肉样　品ＤＮＡ的提取采用常规的酚／氯仿抽提法¨　。提取结束　后取３　ＩｘＬＤＮＡ进行１．０％琼脂糖凝胶电泳，检验是否提　取成功。然后将ＤＮＡ分装并保存于一２０℃，使用时取小　包装保存于４℃。　１．３微卫星位点的选择　根据微卫星位点在近缘物种中的保守性，本实验选　择了曾在黑尾鹿和白尾鹿¨　Ｉ２　等物种中获得良好多态性　

的１８对引物进行筛选（表１）。引物由上海生工生物工　程技术服务有限公司ｆ　Ｓａｎｇｏｎ）合成，并用灭菌双蒸水　配制成浓度为１００　ｔｘｍｏｌ／Ｌ的储存液备用。　

表１　１８对微卫星位点引物序列　

１．４微卫星位点的初步筛选　反应体系总体积为２０　：０．１　Ｌ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨｏｔＳｔａｒ、　２　Ｌ　Ｅｘ　Ｔａｑ　１０×Ｂｕｆｆｅｒ、２　Ｌ　ｄＮＴＰ、２　ｔｘＬ　ＢＳＡ（０．０２　ｍＬ）、０．５　ＩｚＬ上下游引物（１０　ｐｍｏｌ／Ｌ）、模板ＤＮＡ，加　灭菌去离子水至体积为２０　Ｌ。　反应条件：９５℃预变性１０　ｍｉｎ，每个循环包括９５℃　变性３０　ｓ，５１～６０ｏＣ退火４０　ｓ，７２℃延伸１　ｍｉｎ，共４０个　循环，最后７２￣Ｃ延伸１０　ｍｉｎ，４￣Ｃ保存。　使用ＰＣＲ扩增仪（ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００）进　行扩增，并设退火温度梯度和模板ＤＮＡ浓度梯度，以寻　找各对引物的最适退火温度和模板ＤＮＡ量。ＰＣＲ产物　经１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，经ＥＢ染色后，在凝胶成　

像系统中观察扩增效果，并拍照记录。判断各对引物是　否能够从东北马鹿肌肉ＤＮＡ中扩增出特异性产物。选择　有阳性产物的引物扩增随机抽取的８０份粪便ＤＮＡ，并　电泳成像。　１．５筛选多态性高的微卫星位点　将初步筛选出的引物重新合成，在上游引物５　端分别　标记三色荧光ＦＡＭ、ＨＥＸ和ＴＡＭＡＲＡ。使用１７６份粪便　ＤＮＡ样品进行扩增。扩增产物取３　进行１．Ｏ％琼脂糖　凝胶电泳，检验ＰＣＲ反应是否成功，失败的重新扩增。　为获取准确的基因型，本实验重复进行３次ＰＣＲ扩增。　每３种不同荧光标记的阳性ＰＣＲ产物按比例混合成　１组，每组５　Ｌ左右，低温送至北京基诺博实生物技术　野生动物Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｗｉｌｄｌｉｆｅ　２０１０，３１（２）：５９—６２　６１　有限公司测定等位基因的大小，该公司使用ＡＢＩ　３７３０基　因分析仪（ＡＢＩ　３７３０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）。　１．６数据处理　应用Ｃｅｒｖｕｓ　３．０软件，统计各微卫星位点的等位基　因数目、杂合度、多态信息含量、个体识别率及非父排　除概率等参数。　

２结果与分析　２．１　ＤＮＡ提取及检测　对２份肌肉ＤＮＡ和１７６份粪便ＤＮＡ进行１．０％琼脂　糖凝胶电泳（图ｌａ，ｂ），结果显示，提取的肌肉ＤＮＡ和　粪便ＤＮＡ的质量都很高，完全可以用于马鹿的遗传分析。　Ｍ　１　２　Ｍ　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１Ｏ　

２　０００ｂｐ国２０　０ｂｐ圆　

ａ　ｂ　图１　部分东北马鹿ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果　ａ：肌肉ＤＮＡ；ｂ：粪便ＤＮＡ。　２．２微卫星引物的初步筛选　本实验采用的ｌ８对微卫星引物中有ｌ０对在２份肌　肉ＤＮＡ中均可扩增出清晰稳定的谱带。这１０对引物中　有７对在１７６份粪便ＤＮＡ中均可扩增出清晰稳定的条带　（图２）。　Ｍ　１　２　３　４　５　６　７　

图２　ＰＣＲ产物电泳图　１．Ｃｅｒｖｉｄｌ；２Ｎ；３．Ｋ；４．ＢＭ２０３；５．ＢＭ８４８；在ＯＣＡＭ；　７．ＩＬＳＴＳＯ１ｌ　２．３筛选多态性高的微卫星位点　

通过毛细管电泳和基因型分型（图３），使用Ｃｅｒｖｕｓ　３．０软件进行分析（表２）。　

表２　４个微卫星位点的分析　

图３位点Ｎ的毛细管电泳峰值图　由图２可知，位点Ｃｅｒｖｉｄｌ、Ｋ和ＩＬＳｑＶ．．￣Ｉ１的等位基　因数均小于３，Ｎ、ＢＭ２０３、ＢＭ８４８和ＯＣＡＭ的等位基因　数在３～ｌ１个之间，这４个微卫星位点共扩增出２６个等　位基因，平均每个位点有６．５个等位基因，其中，位点　Ｎ的等位基因数为３个，ＢＭ８４８为７个，ＢＭ２０３为１１　个，ＯＣＡＭ为５个。　４个微卫星位点的多态信息含量０．３９３～０．８２７，平　均为０．６４６３，其中，ＢＭ８４８、ＢＭ２０３和ＯＣＡＭ为高度多　态性位点（０．５＞ＰＩＣ），位点Ｎ为中度多态性位点　（０．５＞ＰＩＣ＞０．２５）。观测杂合度范围０．５４１～０．９７３，期　望杂合度范围０．４９６～０．８５７，平均期望杂合度为　０．７０６６，观测杂合度普遍高于期望杂合度。　４个位点的个体识别概率范围在０．６４３～０．９５８之　间，累积个体识别概率为０．９９９９。亲权排除概率范围　０．１２～０．６９１，累积非父排除概率为０．９６９９（ＮＥ一１Ｐ）　和０．９９７６（ＮＥ一２Ｐ）。