内生真菌原生质体制备与再生条件研究
激素、蔗糖浓度和取材时间对洋桔梗花药培养的影响
２４一 ， Ｄ＋３ ／ ０ｇ Ｌ蔗糖。 生 培 养 基 为 ２ ｍ Ｔ ＋ 再 ．５ Ｌ Ｋ
０ ５ｍ ／ Ａ ＋ ３ Ｌ 蔗 糖 。 接 种 后 的 材 料 放 在 温 度 ． ｇ ＬＮ Ａ ０ （６± ）℃ 、 照强 度 １ ０ 、 照 时 间 ８ｈ ｄ的 培养 室 内 。 ２ ２ 光 ０ｌ 光 ５ ｘ ／
．
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Ａ 洋拈 梗 花 药 愈伤 组 织
Ｂ 愈伤 组 织 芽 的分 化 图 ｌ 洋桔 梗 花 药 培 养 再 生 植 株 Байду номын сангаас
Ｃ 花 药愈 伤 组织 的再 生 植株 ．
表１ ３ —５月 份 诱导 培 养基 中激 素 和 蔗 糖 浓 度 对 洋 桔 梗 花 药 愈伤 组 织诱 导 的 影 响
收稿 日期 ：０ ０— ５— １ ２ １ ０ ２
导愈伤率最 高， 达到 ７ ％ ， ０ 极显著 高于 ４月取 材的花 药愈伤
诱导率。
２ ３ 不 同的取 材 时 间对 洋 桔梗 花 药愈 伤 组 织 分化 的影 响 ．
作者简介 ： 周旭红（９ ８ ） 女 ， １７ 一 ， 湖南永州人 ， 硕士 ， 助理研 究员， 主要
２ ２ 同一 培 养基 不 同取 材 时 间 对 洋桔 梗 花 药 愈 伤 组 织 诱 导 ．
的影 响
３ ４ ５月愈伤形成的个数和形成再生植株愈伤的个数 。 、、
１ ２ 试 验 方 法 ．
取花萼与花冠等长 或花冠稍长 于花萼 时的花蕾 ， 预 ４℃
处 理 １ ３ｄ后 ， ５ 的 次 氯 酸 钠 溶 液 消 毒 １ ｉ ， 用 ～ 用 ％ ０ ｒｎ后 再 ａ
微生物发酵生产紫杉醇研究进展
微生物发酵生产紫杉醇研究进展摘要：综述了微生物发酵生产紫杉醇的主要研究进展，包括产紫杉醇的内生真菌的生物多样性、真菌细胞发酵生产紫杉醇的优势，同时也对如何改良内生真菌菌种性能和优化培养基组成及培养条件以提升其产紫杉醇的能力，作出了较为全面的综述。
关键字：紫杉醇，微生物发酵，内生菌，产量前言：目前国外市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮中提炼和人工合成方法，目前并未见有第三种形式形成大规模产业化制作的报道。
紫杉醇的生产受着原材料与科技二个方面的约束，短期内无法突破。
为克服红豆杉资源匮乏和紫杉醇需要量的日益扩大的问题，人类对生产紫杉醇开展了多种多样的科学研究，涉及化学全合成、植物细胞培养、微生物转化和微生物发酵。
微生物发酵法生产紫杉醇由于具备突出优点，其研制与发展日益引起中外科研学者的普遍重视。
一、紫杉醇产生菌的研究进展（一）产紫杉醇的内生真菌的种类Stierle和Strobel等首次从短叶红豆杉的树枝上分离出一个可以形成紫杉醇的内生真菌，命名为安德列亚霉[1]。
当时这一发现对于紫杉醇的药源研究是一次重要的突破，为开发紫杉醇的物源提出了一个崭新的途径。
此后，各地研究者相继进行对产紫杉醇的内生真菌的分离操作，先后在西藏红豆杉、云南省红豆杉、东北地区红豆杉、欧洲红豆杉和中国红豆杉中分离到能形成紫杉醇的内生真菌，其寄主植被基本包括红豆杉属下的所有种类。
在国外的树木中，科学家也分离出来到了可形成紫杉醇的内生真菌。
Li等在不同种类的秃柏的韧皮部和木材部中均分离出能形成紫杉醇的内生真菌[2]。
GA等18人在同一种松树中分离出产紫杉醇的内生真菌。
这表明，产紫杉醇的内生真菌不但存在于红豆杉属植被中，在某些非红豆杉属植被中也存在，他的研究结果更拓宽了产紫杉醇的内生真菌的研究范畴。
（二）真菌发酵制备紫杉醇的优越性与过去在红豆杉植株的树皮上获得的紫杉醇比较，由内生真菌发酵制备紫杉醇有着更多的优越性，微生物发酵方法具有以下特点：（1）微生物发酵的方法易扩大化，有利于工业化生产的落地实施；（2）微生物易于通过诱变育种等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量，微生物育种及选育速度明显高于植物细胞株；（3）内生真菌生长迅速，在简单培养基中便可大量繁殖，形成丰富的发酵活性性质；（4）内生真菌在生物反应器中生长时，可人为调节各项发酵参数，使代谢路径朝着有利于紫杉醇的生产及高浓度紫杉醇的积累的方向进行。
桦褐孔菌原生质体制备与再生
吸去多余 水分。 １０ｍ 湿菌丝体加 １ Ｌ酶液 ， 每 ０ ｇ ｍ
再 生培 养基 ：液 体培 养基 ＋ 脂 ６ｇ Ｌ ， 琼 ・一 以 ０６ｍ ｌＬ ． ｏ・ 蔗糖 配制 ，Ｈ值 ６５ ｐ ．。 再 生 对 照 培 养 基 ： 体 培 养 基 ＋ 脂 ６ｇ Ｌ 液 琼 ・～， 以蒸馏水配制 ，Ｈ值 ６５ ｐ ．。 ０６ｍ ｌＬ ． ｏ・ 甘露醇 、 蔗糖 、 ａ １Ｋ １ Ｎ Ｃ、Ｃ。
天津农业科学 Ｔ ｎｉ ｇｉ ｌ ｒ ｃｅｃｓ ｉ ｊｎ ｒ ｕｔ ａ Ｓｉｎｅ ａ Ａ ｃ ｕｌ
・植 物 生 理 与 生 物 技 术
桦褐 孑 菌原 生质体 制备 与再 生 Ｌ
李 瑁 ， 成 金 郭
（ 天津师 范大 学 生 命科 学学 院 ， 津 ３ ０ ８ ） 天 ０ ３ ７
摘
要： 用正交设计方 法对桦褐孑 菌 原生质体最佳制备 与再生条件从 酶条件 、 采 Ｌ 酶解时 间 、 温度等 ５个方面进行 了研 究 。试
研 究已有许多成功报道 ，但 就桦褐孔菌原 生质体 育 种研究而言 ， 至今鲜见报道 。 笔者利用正交设计
Ｓ Ｃ一 Ｗ— Ｊ ２超 净工 作 台 ，Ｇ 一 ６ Ｔ Ｌ １Ｇ高 速 冷冻 离 心 机 ， Ｈ Ｓ恒温水 浴锅 ， ａ ｎ Ｈ — Ｇ ｌ 显微镜等 。 ｅ 固体斜 面培养基 ： 棉籽皮 ２０ｇ Ｌ ０ ・ 和马铃薯
Ｋ值 大 是 较 好 的试 验 条件 ， 由表 ２可 知 ， 褐 桦
取生长 旺盛的菌丝尖端接种于盛 ５ Ｌ液体 ０ｍ
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
1株产紫杉醇内生真菌的原生质体制备与再生
中 图分 类 号 ：Ｑ ３ ９３ 文献 标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０２～ ３ ２ ２ １ ）２— １０— ３ １０ １０ （０ １ ０ ０ ０ ０
紫杉醇是一种复杂的具有抗癌 活性的二萜生物碱 ， 最早 由美 国的 Ｗａｉ ｎ 等从短叶红 豆杉 （ ａｕ ｒ ｉｌ ） Ｔｘｓ ｅｆ ｉ 中分离出来 ｂ ｖｏ ａ 的 。在生物体内 ， 紫杉醇 的作用机理是 抑制微管 蛋白的
究［ ］ Ｊ ．作物学报 ，０ ７ １ ：２ ２ ０ （ ） １０ห้องสมุดไป่ตู้１５ ２．
陈 文强 等 ： 株 产 紫 杉醇 内生 真 菌 的原 生 质 体 制 备 与再 生 １
１ 材料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
一 ｌ ｌ一 ０
１： （ ３ 菌丝体湿重 ： 酶液体积 ） 的比例将 内生真 菌菌丝体 （ 培 养 ３ｄ 加 入 到 不 同 种 类 酶 配 组 的 酶 解 液 中 ， ３ ） 在 ０℃ 、Ｈ 值 ｐ
物外 ， 还可达到改进产 品质量 、 扩大品种 和简化生产工艺等的
效果 。通过原生质体诱变 ， 选育产紫杉醇 内生真菌的高产菌
株， 发挥 菌 株 的 遗传 潜 力 ， 高 菌 株 的 紫杉 醇产 量 ， 微 生 物 提 为
微生物原生质体制备及再生的影响因素
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
茯苓原生质体制备与再生条件的优化
茯苓原生质体制备与再生条件的优化
汪琪;赵小龙;陈平
【期刊名称】《武汉工业学院学报》
【年(卷),期】2015(000)004
【摘要】对茯苓原生质体形成与再生条件进行研究。
分别从菌丝菌龄、酶种类及浓度、酶解时间、酶解温度4个方面优化了原生质体的制备条件，从再生培养基的成分、原生质体涂布方法、酶解时间3个方面优化原生质体的再生条件。
结果表明：采用培养6天的茯苓菌丝，在3．5％溶壁酶＋1％崩溃酶的混合酶液中，36℃酶解2．5—3 h，获得的原生质体产量最高，可达到39．38×107个／g，双层涂布再生率可达32．7％。
【总页数】5页(P11-15)
【作者】汪琪;赵小龙;陈平
【作者单位】武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023
【正文语种】中文
【中图分类】Q71
【相关文献】
1.茯苓原生质体制备与再生条件的优化 [J], 汪琪;赵小龙;陈平;
2.茯苓原生质体制备与再生条件的研究 [J], 王伟霞;李福后
3.基于响应面法的蟹味菇原生质体制备与再生条件优化 [J], 冯婷婷;郭九峰;宋天磊;春霞;刘超雄;李亚娇;慕宗杰;孙国琴;于传宗;王海燕
4.基于响应面法的蟹味菇原生质体制备与再生条件优化 [J], 冯婷婷;宋天磊;春霞;刘超雄;李亚娇;慕宗杰;孙国琴;于传宗;王海燕;郭九峰
5.茯苓原生质体制备与再生条件初探 [J], 梁清乐;王秋颖;曾念开;王怀凯
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原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
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内生真菌原生质体制备与再生条件研究摘要本文通过对一株产紫杉醇菌株的原生质体的制备与再生
影响因素的研究，结果显示，菌株原生质体制备、再生的最佳条件是2%纤维素酶+3%蜗牛酶组成的复合酶系，30℃，以0.7mol/l nacl 为渗透压稳定剂，酶解时间为6h ，原生质体的得率为5.30?？07个/ml。
在28℃，0.7mol/l nacl为渗透压稳定剂的再生培养基中避光再生培养2d ，原生质体的再生率约为25.63 %。
关键词内生真菌原生质体制备再生。
引言
紫杉醇（taxol）是一种复杂的具有抗癌活性的二萜生物碱，在临床上用于治疗多种恶性肿瘤。
紫杉醇产生菌是周东坡等从东北红豆杉韧皮部分离到的一种内生真菌，紫杉醇产量经hplc测定为51.06 -125.70 g/l ，较1993年以前报道的其它菌种发酵单位高。
在工业微生物领域，将药用菌原生质体诱变技术应用于遗传育种，不仅可以缩短育种时间，降低工作量，而且还可达到改良菌种性状、创造出新的优良性状的效果。
本文通过研究影响紫杉醇产生菌原生质体的分离与再生的酶系统及菌龄，从而筛选出适合的原生质体分离与再生的条件，为其诱变育种奠定基础。
一、材料与方法
（一）材料
1、供试菌种产紫杉醇taxol-8菌株，由陕西国际商贸学院微生物与免疫实验室提供。
2、培养基 pda液体培养基；pda固体培养基；再生培养基。
3、酶解液 2.00﹪纤维素酶；2.00%蜗牛酶；不同比例的纤维素酶和蜗牛酶组合酶系。
4、试剂渗透压稳定剂： 0.7mol/l nacl，ph6.0；工具酶：蜗牛酶、纤维素酶。
5、仪器与设备恒温振荡器；高速低容量冷冻离心机；光学显微镜。
（二）方法
1、菌种活化配制母种培养基，分装试管，于121.3℃灭菌30 min后放置斜面， 28℃培养后，4℃冰箱备用。
2、液体培养制备液体培养基分装，30 ml/100 ml，于121.3℃灭菌30 min，种接，28℃恒温培养24h后，1000 r/ min 振荡培养。
3、收集菌丝体抽滤发酵液得菌丝体，以无菌水和渗透压稳定剂各洗涤3次（5min/次）。
4、原生质体制备将菌丝体置于1ml的离心管中，按1：3（菌丝体湿重g：酶液体积ml）的比例，30℃，ph6.0的条件下进行酶解。
酶解过程中每隔1h振荡1次，使酶解液均匀，反应期间每隔1h吸取少量酶解液镜检，观察原生质体产生情况。
4500 r/ min离心10 min后弃去上清液，用稳渗剂洗2次后重新悬浮于0.7mol/l nacl的稳渗剂中，镜检，计数。
原生质体制备率（fp）=原生质体个数（np）/酶解液体积（v）
5、原生质体再生取原生质体悬液200 l置于再生培养基，将
原生质体用无菌水低渗处理作对照，于28℃下培养2d，镜检计数，求再生率。
再生率=（再生菌落数- 对照处理再生菌落数）/镜检原生质体数/ml?？.2?？00%.
二、结果与分析
（一）紫杉醇产生菌原生质体的制备
1、不同种类酶液对原生质体制备率的影响按1︰3（菌丝体湿重g：酶液体积ml）的比例将菌丝体（培养9d）加入到不同种类酶液中，30℃，ph6.0的条件下酶解6h。
不同种类酶液对原生质体产率的影响见表1。