细胞穿膜肽pep-1与vMIP-Ⅱ的融合表达与纯化
TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测
TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测王中山;张梦;张美娴;陈淑漫;朱焘;方佳炜;杨静;戴毅【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2018(029)003【摘要】目的:获得NR2B羧基端多肽(NR2Pep),探讨TAT-NR2Pep在细胞中的跨膜特性.方法:利用酶切连接方法构建pWaldo-TAT-pep质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,检测不同浓度诱导剂和不同温度对蛋白质表达的影响;利用镍柱亲和层析及分子筛方法纯化TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,利用GFP发荧光的特性采用In-gel检测蛋白质的表达情况;以融合蛋白C端His标签特异性抗体,通过Western印迹确定融合蛋白的表达;荧光显微镜下观察TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白在CHO和C2C12等细胞中的跨膜活性.结果:构建了TAT-NR2Pep-GFP表达载体,重组菌经0.1 mmol/L IPTG于22℃诱导20 h能够表达较多高质量的目标蛋白;In-gel荧光检测证实融合蛋白TAT-NR2Pep-GFP拥有正确构象,GFP能够发出绿色荧光;Western印迹分析表明融合蛋白相对分子质量符合预期;细胞穿膜实验证实TAT能够介导多肽穿过细胞膜.结论:原核表达并纯化得到TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,该蛋白散发绿色荧光,能够穿过细胞膜.【总页数】5页(P340-344)【作者】王中山;张梦;张美娴;陈淑漫;朱焘;方佳炜;杨静;戴毅【作者单位】徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221004;徐州市中心医院,东南大学附属医院妇产科,江苏徐州221009;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学临床学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004;徐州医科大学麻醉学院,江苏徐州221004【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.细胞穿膜肽TAT与小鼠干细胞转录因子Oct4融合表达及纯化 [J], 王军;雷楗勇;陈蕴;金坚2.Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性 [J], 关新刚;苏维恒;于欣;佟海滨;孙新3.重组人酸性成纤维细胞生长因子-穿膜肽融合蛋白的克隆表达、纯化及活性检测[J], 张睿;王晓杰;王怡;田海山;焦悦;高丽昌;李婷婷;李校堃4.TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定 [J], 王桂华;孙黎;邓豫;李小兰;曹小年;来森艳;陶德定;胡俊波5.穿膜肽介导苦荞金属硫蛋白的表达、纯化及抗氧化损伤作用 [J], 何永吉;李云龙;胡俊君;范晓军;李红梅;程哲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞穿膜肽的治疗应用
细胞穿膜肽的治疗应用刘金华【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2011(017)001【摘要】Cell-penetrating peptides(CPPs)are some small peptide molecules with cell membrane penetrating capability, which can bring protein, polypeptides, nucleic acid into cells without any significant side effects on host cells.Although the mechanisms of membrane penetration is not clear and even controversial, CPPs are still widely used in life science research fields,including basic and clinical researches.CPPs have shown their roles in tumor,cardiomyopathy and immunotherapy studies, with a wide range of applications.%细胞穿膜肽(CPPs)是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,能将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入哺乳动物细胞内,其转导效率高且不会造成细胞损伤.CPPs的具体穿膜机制尚不清楚,甚至互相矛盾,但并不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用.CPPs已经在肿瘤、心肌病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景.【总页数】3页(P10-12)【作者】刘金华【作者单位】广西医科大学基础医学院免疫学教研室,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】R341【相关文献】1.基于小热休克蛋白-细胞穿膜肽蛋白纳米粒的siRNA递送系统 [J], 王浩;刘宁;陈丽;崔梅英;王冬梅;刘宇轩;关新刚2.细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达 [J], 李风;柯博文;孙中伟;韩双艳3.细胞穿膜肽S4(13)与质膜相互作用的分子动力学模拟 [J], 高金爱;崔巍4.细胞穿膜肽的分类和穿膜机制研究进展 [J], 王红梅;王春玲;邹艳;杨海莲5.细胞穿膜肽作为载体的研究进展 [J], 闫可心;闫宗斌;韩金成;张雪梅;薛书江;许应天因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
【推荐下载】PEP？1？SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性研究
PEP？1？SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性研究 2012-12-06 【编者按】：护理论文是科技论文的一种是用来进行护理科学研究和描述研究成果的论说性文章。
论文网为您提供护理论文范文参考，以及论文写作指导和格式排版要求，解决您在论文写作中的难题。
作者：张友恩，王家宁，唐俊明，郭凌郧，杨建业，黄永章，郑飞，孔霞 【摘要】目的：研究PEP?1?SOD1融合蛋白转导进入大鼠心肌组织的能力，并测定转导的目的蛋白酶活性. 方法：实验分为SOD1组和PEP?1?SOD1组，分别经大鼠尾静脉注射500 g纯化后的SOD1及500 g纯化后的PEP?1?SOD1融合蛋白入大鼠体内，于注射后0.5，1，2，4，8，24 h时间点取心脏(n=6，每组，每个时间点)，经40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后行冰冻切片，通过免疫组织化学方法检测PEP?1?SOD1进入大鼠心肌组织的能力和分布情况. 黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织SOD1 活性. 结果：PEP?1?SOD1组注射后0.5 h时，大鼠心肌组织中即出现均一的明亮红色荧光信号，分布于细胞浆及细胞核，具有时间依赖性的特点，荧光强度最强点为1 h 时间点，而SOD1组未见到红色荧光信号. 于注射后0.5 h时SOD1活性开始升高PEP?1?SOD1组为(85.37 1.67)，SOD1 组为(52.23 0.67)，两组相比较，差异具有统计学意义(P 0.01);注射后1 h时SOD1 活性可达高峰，PEP?1?SOD1组为(119.16 1.37)，SOD1 组为(53.47 1.02)，两组相比较，差异具有统计学意义(P 0.01)，2～24 h逐步下降;SOD1组各时间点间相比较差异无统计学意义(P 0.05). 结论：PEP?1?SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导入大鼠心肌组织，并保持酶活性达24 h. 【关键词】细胞穿透肽;PEP?1肽;超氧化物歧化酶 0引言 研究发现，只有高度脂溶性、分子质量不超过600道尔顿的化合物或6个氨基酸残基以下的小肽才能直接透过细胞膜或血脑屏障，这为无特异受体/通道和入胞方式的具有治疗作用的大分子物质有效地发挥功效造成了极大的障碍. PEP?1是Morris等[1]设计的一种新的细胞穿透肽(cell penetrating peptide, CPP)，PEP?1能够把?半乳糖苷酶( ?galactosidae，?Gal)，抗体、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)，人Cu，Zn?SOD等大分子物质以天然活性形式转导入细胞内而不需预变性[2-3]. 铜，锌?超氧化物歧化酶(Cu，Zn?superoxide dismutase;SOD1)是细胞中高水平表达的SOD形式，可以专一性清除超氧阴离子(O2-)，从而防止氧应激损伤[4]. 由于SOD1系大分子物质，在生物体内无特异受体和通道，也不能依靠内吞作用等人胞方式进入细胞内，生物学作用的发挥受到很大的限制. 本研究通过基因工程手段表达和纯化SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白，研究PEP?1?SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性，为临床应用抗氧化酶SOD1治疗氧应激损伤提供依据. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠72只，体质量(250 20) g，(湖北省实验动物中心);pBluescript ⅡSK?SOD1质粒(美国西奈山医学院生物化学/药理学系白景香博士惠赠);pGEM?T easy vector 系统(美国Promega公司);pET15b，E.coli BL21(DE3)(美国Novagen公司);DH5 (郧阳医学院临床医学研究所提供);PEP?1肽DNA序列(北京赛百盛基因技术有限公司);异丙基硫化? ?D?半乳糖苷(isopropy? ?D?thiogalactoside, IPTG)(美国Promega公司);兔抗His?probe(G?18)抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司);小鼠抗心肌TnT抗体，四乙基若丹明异硫氰酸盐(tetraethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC)标记的山羊抗兔二抗、异硫氰酸荧光素(fluoresein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗小鼠二抗(美国KPL公司);4，6?二氨基?2?苯基吲哚(4,6?Diamidino?2?phenylinole, DAPI)(美国Sigma公司);SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所). 1.2方法 1.2.1SOD1，PEP?1?SOD1融合蛋白的表达、纯化和鉴定将构建的原核表达质粒pET15b?SOD1[5]，pET15b?PEP?1?SOD1[6]分别转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，用IPTG诱导分别表达出SOD1和PEP?1?SOD1 目的蛋白，采用Ni2+?金属螯合亲和柱层析对其进行纯化，对纯化后的蛋白取样，进行SDS?PAGE电泳，将样品蛋白转移到NC膜上，用抗His?tag抗体孵育，采用Western Blot显示分析. 以牛血清白蛋白(1 g/L)做标准对照，采用Bradford法进行蛋白浓度定量. 1.2.2实验动物分组将大鼠随机分为SOD1组和PEP?1?SOD1组. SOD1组经尾静脉注射500 g纯化后的SOD1;PEP?1?SOD1组经尾静脉注射500 g纯化后的PEP?1?SOD1融合蛋白. 两组分别于注射后0.5，1，2，4，8，24 h时间点取心脏(n=6，每组，每个时间点). 1.2.3免疫组织化学方法评价PEP?1?SOD1在活体大鼠心肌组织的转导能力SOD1组和PEP?1?SOD1组，于注射后相应时间点迅速取大鼠心脏，切成两半，一半置-80℃冰箱冻存. 另一半经40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后行冰冻切片，PBS漂洗10 min 3，加兔抗His?probe抗体(1∶200)，小鼠抗心肌TnT抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，PBS漂洗10 min 3，加TRITC标记的山羊抗兔抗体(1∶200)，FITC标记的山羊抗小鼠抗体(1∶200)，室温孵育2 h，PBS漂洗10 min 3，加DAPI湿盒染色15 min，PBS漂洗5 min 3，抗荧光淬灭封片液封片后于倒置荧光显微镜下观察摄像. 1.2.4心肌组织S OD1活性测定取纯化后的SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白冻存的心肌组织，精确称重，加9倍组织块重量的冷生理盐水，超细匀浆器制备组织匀浆，按SOD检测试剂盒说明书黄嘌呤氧化酶法测定其酶的活性. 统计学处理：计量资料以x s表示，使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，并结合LSD检验进行两两比较. P 0.05为差异具有统计学意义. 2结果 2.1Western Blot鉴定纯化后的目的蛋白SOD1和PEP?1?SOD1经SDS?PAGE和Western Blot检测，发现分别在Mr约为22 103和26 103处有相应的单一杂交条带(图1). Bradford法测得SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白的产量分别为158.5 g/L和212.1 g/L. 2.2纯化后的蛋白酶活性黄嘌呤氧化酶法测定纯化后的SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白的SOD1 活性分别为15.87 103U/g和12.23 103U/g. tips:感谢大家的阅读，本文由我司收集整编。
PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化
PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化丁鹏;王家宁;杨波;黄永章;骆丽娜【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2006(19)3【摘要】目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。
方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。
经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。
结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。
结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。
【总页数】4页(P240-243)【关键词】铜,锌-超氧化物歧化酶;原核表达;TA克隆;PEP-1肽;融合蛋白【作者】丁鹏;王家宁;杨波;黄永章;骆丽娜【作者单位】武汉大学医学院附属人民医院;郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所;河南省平顶山煤业集团总医院【正文语种】中文【中图分类】R996.3;R392.12【相关文献】1.自剪切重组麦芽糖结合蛋白-人鼻病毒3C 蛋白酶融合蛋白在大肠杆菌表达系统中表达、纯化及活性检测 [J], 董哲君;赵海舰;许小毛;方保民;郭健;肖飞2.HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化 [J], 蒋卫民;卢洪洲;潘孝彰;康来仪;尹春煜;胡越凯;翁心华3.HBx-EGFP-TLM融合蛋白表达载体的构建、蛋白表达纯化及活性检测 [J], 史晓燕;张莹莹;周晓巍;陆健昇;郭泽坤;黄培堂4.人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定 [J], 赵洪亮;薛冲;熊向华;张伟;杨秉芬;刘志敏5.利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白 [J], 张云静;张蓉;叶棋浓;冯滢滢;徐小洁;梁迎春;张立;王涛;李玲;郭靖;纪贝贝因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
穿膜肽-TDRG1重组蛋白原核表达载体的构建
穿膜肽-TDRG1重组蛋白原核表达载体的构建陈厚仰【期刊名称】《现代诊断与治疗》【年(卷),期】2017(028)017【摘要】构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体.以pYD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段.同时利用内切酶对已构建好的载体pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证.PCR 扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致.成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT.【总页数】4页(P3143-3146)【作者】陈厚仰【作者单位】江西省妇幼保健院辅助生殖中心,江西南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R34【相关文献】1.一种人源性穿膜肽融合蛋白中连接肽的引入及其在 HeLa细胞中的穿膜活性 [J], 李堰忠;杨旭中;吕强;王富军;赵健2.跨膜转导肽TAT、9R和牛Sox2融合蛋白原核表达载体的构建与表达研究 [J], 贾文超;甘鹏;熊亮;潘传英;蓝贤勇;陈宏3.携带信号肽NT4-GFP-穿膜肽Ant融合基因的重组腺相关病毒载体的构建及意义[J], 吴昊;吴江;杨宇;孙欣;杨广笑;王全颖4.细胞穿膜肽的分类和穿膜机制研究进展 [J], 王红梅;王春玲;邹艳;杨海莲5.穿膜肽TAT-p38αG融合基因的构建、表达及穿膜特性的鉴定 [J], 张家平;应希;陈渝;张琼;黄跃生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞穿透肽 纳米课题
细胞穿透肽
细胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP）是一种能够携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用，非ATP依赖。
近年来，CPP作为一种潜在的药物输送高效转运载体得到了研究者的广泛关注。
研究发现，CPP能够通过多种机制进入细胞，包括非内吞途径、膜孔道形成、膜脂质相互作用等。
同时，CPP还具有良好的生物相容性、低免疫原性和易于化学修饰等优点，因此被广泛应用于药物递送、基因治疗和纳米生物材料等领域。
细胞穿透肽（CPP）是一种能够携带大分子物质进入细胞的短肽。
其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用，而是通过多种机制实现。
主要机制是：
1. 非内吞途径：CPP可以通过直接穿越细胞膜的方式进入细胞，这种机制称为非内吞途径。
研究表明，一些CPP如TAT 和Pep-1可以通过这种方式进入细胞。
2. 膜孔道形成：一些CPP可以形成孔道或通道，从而将大分子物质运输到细胞内部。
例如，聚精氨酸（polyarginine）和其类似物可以形成孔道，使细胞膜变得通透，从而促进大分子物质的进入。
3. 膜脂质相互作用：CPP还可以与细胞膜上的脂质分子发生相互作用，从而改变膜的结构和通透性。
例如，一些CPP如
Melittin和SynB可以通过与膜上的磷脂分子结合，改变膜的结构，从而促进大分子物质的进入。
总之，CPP的穿膜机制多种多样，不同的CPP可能采用不同的机制。
这些机制的深入了解有助于设计更加高效和特异性的药物递送系统。
细胞穿膜肽在PHPV融合因子及其它多肽类物质运输中的应用
细胞穿膜肽在PHPV融合因子及其它多肽类物质运输中的应用摘要】细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。
目前已有科学家将细胞穿膜肽应用于基因治疗。
细胞穿膜肽具有以下特性：①具有净正电荷性和两亲性；②穿膜转运效率高；③可以导入近乎所有的细胞；④可以携带多种活性物质进入细胞；⑤可靶向穿透细胞膜，达到灭活多种病毒且不造成细胞损伤。
【关键词】细胞穿膜肽；穿膜能力；基因治疗；灭活病毒；靶向穿透；PHP；融合因子1、细胞穿膜肽细胞穿膜肽（cell penetrating peptides）是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。
穿膜肽是由小于30个氨基酸组成的具有细胞穿透功能的小肽，它能通过与细胞膜的相互交联作用而穿过细胞膜这一天然屏障。
经过对天然存在的细胞穿膜肽的生物化学性质研究，已经逐渐掌握了细胞穿膜肽的一些共有特性，这类物质均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，二级结构皆具有α-螺旋的空间构象。
利用这些特性，目前已人工合成了穿透力更强、效率更高的穿膜肽PEp-1、MPG，并且成功地携带大分子物质进入细胞发挥生物学活性。
也有学者称这类短肽为蛋白转导域或特洛伊木马肽。
2、细胞穿膜肽与基因治疗目前已有科学家将细胞穿膜肽应用于基因治疗。
最近通过设计获得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，能够引导所承载的寡肽-1修复蛋白穿透细胞膜，经表皮渗透吸收，富含碱性氨基酸，含有较多的正电荷的肽片段，靶向导入皮肤基底层受体[1]。
该穿膜肽具有以下特性：①具有净正电荷性和两亲性；②穿膜转运效率高；③可以导入近乎所有的细胞；④可以携带多种活性物质进入细胞；⑤可靶向穿透细胞膜，达到灭活多种病毒且不造成细胞损伤。
3、细胞穿膜肽在PHPV融合因子或其它物质中的运载功能大量研究表明,穿膜肽具有强大的运载潜能,与其他生物大分子转运方式相比,穿膜肽的转导作用具有许多独特之处。
带vec穿膜肽的超氧化物歧化酶重组质粒、融合蛋白及构建方法
带vec穿膜肽的超氧化物歧化酶重组质粒、融合蛋白及构建方法1.引言1.1 概述超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，在生物体内可以将有害的超氧自由基转化为无害的氧气和过氧化氢。
然而，由于其本身的不稳定性和低效性，应用范围有限。
因此，加强对超氧化物歧化酶的研究，寻找新的改进方法具有重要意义。
在本文中，我们提出了一种新的改进方法，即通过引入vec穿膜肽来构建超氧化物歧化酶重组质粒和融合蛋白。
vec穿膜肽是一种具有细胞穿透能力的多肽，能够有效地将外源基因导入到靶细胞内。
通过引入vec穿膜肽，可以提高超氧化物歧化酶在细胞内的表达效率和稳定性。
本文的主要目的是探索使用vec穿膜肽来改善超氧化物歧化酶的表达和功能。
首先，我们将详细介绍超氧化物歧化酶重组质粒的构建方法，包括选择适当的表达载体、设计合适的引物和连接酶。
然后，我们将介绍如何构建融合蛋白，将超氧化物歧化酶与vec穿膜肽融合在一起，以提高细胞内的表达效率和稳定性。
通过本文的研究，我们期望能够提供一种新的改进方法，用于增强超氧化物歧化酶的抗氧化能力，并为相关领域的研究和应用提供有价值的参考。
此外，我们还将探讨可能的拓展方向，进一步开发和优化超氧化物歧化酶的改良策略，以满足不同领域的需求。
在接下来的章节中，我们将详细介绍超氧化物歧化酶重组质粒的构建方法和融合蛋白的构建过程，并总结本研究的主要结果和意义。
通过本文的研究，我们希望能够为超氧化物歧化酶的改进提供新的思路和方法，并为相关领域的研究和应用做出贡献。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以描述为以下内容：在本文中，将介绍带有vec穿膜肽的超氧化物歧化酶重组质粒以及融合蛋白的构建方法。
文章将按照以下结构进行组织和阐述：第一部分是引言。
概述了文章要研究的问题和背景，并对文章的结构和目的进行了概述。
第二部分是正文。
首先介绍了超氧化物歧化酶重组质粒的构建方法，包括质粒的构建、转染和筛选等步骤。
然后详细阐述了如何将vec穿膜肽引入质粒中，以便提高质粒在细胞内的转染效率和稳定性。
TAT-EGFP融合蛋白的表达、纯化及穿膜活性研究的开题报告
TAT-EGFP融合蛋白的表达、纯化及穿膜活性研究的开题
报告
介绍：
TAT-EGFP融合蛋白是一种化学合成的蛋白质，由TAT导入肽和EGFP融合而成。
该蛋白可以穿透细胞膜并进入细胞内部，使未被内生信号肽导入的蛋白质也能够进入
细胞，被广泛应用于细胞内嵌入亚细胞结构或组织培养实验中。
本实验选用大肠杆菌作为表达宿主，对TAT-EGFP融合蛋白进行表达、纯化、穿膜活性的研究。
目的：
1. 高效表达TAT-EGFP融合蛋白
2. 进行蛋白纯化，获取高纯度TAT-EGFP融合蛋白
3. 研究TAT-EGFP融合蛋白在细胞内的穿膜能力
方法：
1. 底物的构建
将TAT和EGFP基因进行连接，使用基因重组技术构建TAT-EGFP融合蛋白底物。
2. 大肠杆菌的转化
将构建好的底物质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中。
3. 蛋白表达
通过IPTG诱导，利用大肠杆菌对底物进行表达，收集菌株进行后续操作。
4. 蛋白纯化
采用Ni+质粒亲和层析法，结合SDS-PAGE和Western blot分析，纯化TAT-EGFP融合蛋白。
5. 细胞实验
通过荧光显微镜及流式细胞仪等技术，研究TAT-EGFP融合蛋白的穿膜能力。
预期结果：
成功表达、纯化TAT-EGFP融合蛋白，并证明其具有穿膜能力，为进一步研究该蛋白质在生物学及医学领域的应用奠定基础。
细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞
细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞董晓;王家宁;黄永章;郭凌郧;孔霞【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2007(29)1【摘要】目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力.方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性.结果 EGFP蛋白不能进入细胞内.PEP-1-EGFP融合蛋白可在5 min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27 h仍可观察到微量绿色荧光.PEP-1-EGFP蛋白浓度达200 μmol/L时对细胞仍无毒性.结论 PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础.【总页数】6页(P93-97,插3)【作者】董晓;王家宁;黄永章;郭凌郧;孔霞【作者单位】郧阳医学院,附属人民医院临床医学研究所,湖北十堰,442000;郧阳医学院,附属人民医院临床医学研究所,湖北十堰,442000;郧阳医学院,附属人民医院临床医学研究所,湖北十堰,442000;郧阳医学院,附属人民医院临床医学研究所,湖北十堰,442000;郧阳医学院,附属人民医院临床医学研究所,湖北十堰,442000【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导 [J], 董晓;王家宁;唐俊明;潘国栋;黄永章;杨建业;曹书芬2.细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人结直肠癌SW480细胞 [J], 董晓;王家宁;黄永章;郭凌郧;孔霞3.细胞穿透肽PEP-1介导过氧化氢酶转导大鼠心肌H9C2细胞 [J], 黄光庆;王家宁;唐俊明;郭凌郧;郑飞;孔霞4.细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白穿透在体小鼠皮肤 [J], 董晓;王家宁;潘国栋;黄永章;郭凌郧;曹书芬5.PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞 [J], 姚玲玲;王家宁;黄永章;陈龙;郭凌郧;孔霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ｐ Ｔ１ ｂ ｐ ｐ １ ｖ Ｐ Ｉ ｓｎ ｈ ｓｓｆｏ ｃ ｌｐ ｒ ｅ ｂｅｐ ｐ ｉｅｐ ｐ １ａ ｄ ｖｒｌ ｃｏ ｈ ｇ ｆ ｍｍａｏ ｒ — Ｅ － ｅ 一 一 ＭＩ —Ｉ ， ｙ ｔｅ ｉ ｒ ｍ ｅｌ ｅ ５ ｍ ａ ｌ ｅ ｔ ｅ 一 ｎ ｉａ ｍａ ｒｐ ａ ｅｉｌ ｄ ｎ ａ ｔ ｒ ｐ ｏ ｙ
Ⅱ） 的融 合表 达质 粒 ｐ Ｔ１ｂｐｐ １ｖ Ｐ Ⅱ， 将其 转 化大肠 杆 菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） ｌｓ Ｅ ５ ．ｅ一一ＭＩ一 并 Ｌ １ Ｄ ３ ｐｙＳ中经 ＩＴ 诱 导表达 ， ＰＧ
经 Ｓ ．Ａ Ｅ和 Ｗｅｔｍ．ｌｔ 定 出可溶性 的融合 蛋 白 ｐ ｐ １ｖ Ｐ ｌ。通过 对 ＩＴ ＤＳＰ Ｇ ｓ ｂｏ 鉴 ｅ ｅ 一 一 ＭＩ —Ｉ Ｐ Ｇ浓 度 、 温度 等诱 导表 达 条 件 进 行 优 化 ， 确 定 在 ＩＴ 浓 度 为 ０ ＰＧ ． ｍｍｏ／ 、 ８ ２ ｌ ２ ℃下 诱 导 ７ｈ可 溶 性 蛋 白的表 达 量 相 对 较 高 ， Ｌ 经 Ｎｉ Ａ亲 和层 析 ， 滤 除盐 纯化 获得 高纯 度 的融 合 蛋 白 ｐｐ １ｖ Ｐ １ 将 该 蛋 白作用 于 Ｈ ｌ ＮＴ 超 ｅ 一 一 ＭＩ一Ｉ， ｅａ细胞 ， 光 激 共聚 焦显微 镜观 察结果 显示 该融合 蛋 白能够携 带 目的基 因穿透 细胞膜 。本文 结果 将为进 一 步研究 ｖ Ｐ １ ＭＩ一１ 的功 能和细 胞穿膜 肽技 术 的应 用奠 定基础 。 关键 词 ｖ Ｐ １， ｅ 一 ， Ｍ１一 Ｉ ｐ ｐ １ 细胞 穿 膜肽 ， 核表 达 原
Ｍ ａ ａ ｅ ｎ ， ｎ ｚ ｏ ｒ ａ ｉ ｅ ｓｔ ， ｎ ｚ ｏ ， １ ０ ６ ｎ ｇ ｍｅ ｔ Ｈａ ｇ ｈ ｕ Ｎｏ ｍ ｌ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ Ｈａ ｇ ｈ ｕ ３ ０ ３ ｙ
Ｃ ｒ ｓｏ ｄｎ ｔｏ， ａｇｅ６ ＠ｙｈ ｏｃｍ ｏｒ ｐ ｎ ｉｇａ ｈ ｒｙｎ ｌｉ２ ａｏ ． ｅ ｕ ｏ
ｔｉ一Ｉ ｗ ｓ ｒｎｄ ｃｅ ｔ ｓｈ ｒ ｈａｃ ｌＢ ２ Ｄ ３ ｐｙＳ Ｔ ｅ ｘ ｒｓｉｎｐｏ ｕ ｔｎ ｕ ｅ ｙＩＴ ｓ— ｅ １， ａ ａ ｓｕ ｔ ｉ ｏＥ ｃ ｅｉ ｉ ｏ Ｌ Ｅ ） ｌｓ ． ｈ ｐｅｓ ｒｄ ｃ ｉｄ ｃ ｄｂ Ｇ ｗａ ｎ ｔ ｄｎ ｃ ｉ １（ ｅ ｏ Ｐ ｉ
基 因组 学 与 应用 生 物 学 ，０ ０年 ， ２ 卷 ， ６ ， １２ — ０ ２页 ２１ 第 ９ 第 期 第 ０ ６ １３
Ｇｅ ｍ ｉ ｎ ｐｌｅ ｏ ｏ ｙ， ０１ Ｖｏ１ ， ｏ．，１ ２６ ０３ ｎｏ ｃｓａ ｄ Ａｐ ｉ ｄＢｉ ｌ ｇ ２ ０， ． Ｎ ６ ０ —１ ２ ２９
Ｄ ：Ｏ３ ６ 幢ａ ． ９０ １２ ＯＩ１ ． ９ ｂ０ ． ０ ６ ９ ２ ０
Ａｂ ｔａｃ Ｃｅ ｌ ｅ ｍ ｅ ｂｌ ｅ ｔｄ ｓａｋ ｎ ｆｓ ｌ ｐ ｐｔｄ ｓｔ ａ ｒ ａ ａ ｌ ｆｂ ｉ ｇ ｎ ｃ ｏ ｏｅ ｕ ｅ ｎ ｏ ｃ ｌ ｓｒ ｔ ｌ ｐ ｒ ａ ｅｐ ｐ ｉ ｅｉ ｉ ｄ ｏ ｍａ ｌ ｅ ｉ ｅ ｈ ｔ ｅ ｃ ｐ ｂ ｅｏ ｒｎ ｉ ｇ ｍｉｒ ｍ ｌｃ ｌ ｓｉ ｔ ｅｌ ａ ｍ ｅ ｂｒ ｎ ， ｈｅｃ ｌ ｒ ｅ ｔｏ ｂ ｌｔ ｆｗｈｉｈ ｉ ｎｄ ｐｅ ｄｅ ｔｏｆｃ ａ ｓｃ ｅ ｄ ｃ ｔ ｓｓ Ｉ ｈ ｓａ ｔ ｌ ， ｈ ｌ ｓ ｄ ｍｅ ａ ｅ ｔ ｅｌｐｅ ｍ ａ ｉ ｎ ａ ｉｉ ｏ ｃ ｓｉ ｅ ｎ ｎ ｌｓ ｉ ｎ ｏ ｙ ｏ ｉ． ｎ ｔ ｉ ｒｉ ｅ ｔ ｅ ｐ ａ ｍｉ ｙ ｃ
Ｌｕ ｎ ｏ Ｙａ Ｔａ ａ ｈｕ ｎＸｉｏ ａ Ｄｉ ｕ ｈｏ ｇ Ｃｈ ｎ ｎ Ｃｈｅ ｉｎ ｉ ｇ ｎｇＪａ ｂ ｎ Ｃｈ ｎ Ｊａ ｏ ｅ ｉ ｈ ｎｇ Ｙａ ｉ ｎｇＬｅ ＿
１Ｌｂ ｒｔｒ ｆ ｎｉ ｇＥ ｄｍｉ ｄＥｈ ｉＤｉ ａｅ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉ ｃｅｃｓＳ ｉｅｉ ｉｅｓｙ Ｓ ｉｅｉ８２ ０ ； ｏｌｇ ｆ ｄｃｎ ｎ ａｈ ａｏａｏｙｏ Ｘｉ ａ ｎ ｅ ｃａ ｔｎｃ ｓ ｓ， ｏｌ ｅｏ Ｌｆ Ｓ ｉ ｅ， ｈｈ ｚＵｎｖ ｒｔ， ｈｈ ｚ， ３０ ０ ２Ｃ ｌ ｅｏ Ｍｅ ｉ ｅ ｄＨｅｌ ｊｎ ｎ ｅ ｅ ｅ ｎ ｉ ｅ ｉ ａ ｔ
Ｔｈ ｕ ｉ ｎＥｘ ｒ ｓｉ ｎａ ｄＰ ｒｆｃ ｔｏ ｎＣｅｌ ｒ ｅ ｂ ｅＰ ｐ ｉ ｅｐｅ — ｎ ｅＦ ｓｏ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ｕ ｉ ａｉ ｎｏ ｌＰｅ ｍ ａ ｌ ｅ ｔｄ ｐ—１ａ ｄ ｉ
Ｖｉ ｌ ａ ｒｐ ａ ｅＩ ｆ ｍｍａｏ ｙＰ ｏｅｎ ｒ ｃｏ ｈ ｇ ｌ ａＭ ｎａ ｔｒ ｒ ｔｉ一Ⅱ
管理 学 院 ， 州， １０ ６ 杭 ３ ０ ３
通讯作者，ａ ｇｅ６＠ｙ ｈ ｏｃｍ ｙｎｌ ２ ａ 是一类 能携 带大 分子物质 进入 细胞 的短肽 ， 穿膜能 力不 依赖经 典 的胞吞作 用 。 其 本研究
构 建 了含有细胞 穿膜肽 ｐｐ １ ｅ 一 和病 毒 巨噬细胞 炎症 蛋 白 一 （ｉ ｌ ｃｏ ｈ ｇ ｉｆ ｍｍａ ｒ ｐｏｅ 一 ｖ Ｐ １ ｖｒ ｍａｒｐ ａ ｅ ｎ ａ ａ ｌ ｔ ｙ ｒｔｉ Ⅱ， ＭＩ一 ｏ ｎ
研 究报 告
Ａ ｔ ｒ Ｌｅｔ ｅ
细胞 穿膜肽 ｐ ｐ １ ｖ Ｐ Ⅱ的融合表 达与纯化 ｅ一 与 ＭＩ一
罗燕 谭 晓华 狄春 红 ｚ 程 建兵 陈佳 红 杨磊 ｌ １ ２
１ 河 子 大 学 新疆 地 方 病 与 民族 高 发 病 省部 共 建 教 育 部 重 点 实验 室 ， 疆 石 河 子大 学 生命 科 学 学 院 ， 河 子 ， ３ ０ ２ ２杭 州 师 范 大 学 医 药 卫 生 石 新 石 ８２０；