大鼠异基因骨髓移植模型的实验研究

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持久稳定的大鼠→小鼠造血嵌合体模型的建立

持久稳定的大鼠→小鼠造血嵌合体模型的建立【摘要】目的：建立持久稳定的造血嵌合体模型. 方法：将预处理后的SD大鼠经尾静脉注射BALB/c小鼠骨髓细胞，诱导形成特异性耐受的嵌合体SD大鼠. 30 d后，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给致死性照射后的BALB/c小鼠，监测小鼠的存活率，移植后30 d做皮片移植和混合淋巴细胞培养，观察小鼠嵌合率的变化. 结果：嵌合体模型小鼠仅有轻度移植物抗宿主病的表现，生存期明显延长，移植后嵌合率较稳定，移植皮片存活期延长，与对照组相比有显着性差异. 结论：通过输入嵌合体骨髓的方法可建立稳定持久的大鼠→小鼠嵌合体模型.【关键词】嵌合体模型；全身照射；骨髓移植0引言大鼠→小鼠的骨髓移植，通过对受体进行强烈的清髓性预处理或注射大量骨髓以获得可靠植活，但异种移植物抗宿主病较强，且嵌合状态随时间延长逐渐消失. 为建立稳定的异种造血嵌合体，我们研究了协调性动物的骨髓移植模型，因为他们之间不存在天然的抗体，对异种移植物不会发生超急排斥(hyperacute rejection, HAR). 先对供者进行预处理，使其产生对小鼠的特异性耐受，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给小鼠. 由于此前嵌合体大鼠已对小鼠产生了特异性耐受，故将此耐受的骨髓植入小鼠体内可明显减轻XGVHD，并诱导出持久稳定的嵌合状态.1材料和方法1材料SD大鼠(SPF级)8只，雌性，8～10周龄. C57BL/6(H2b)小鼠6只，雌性，8～10周龄. BALB/c(H2 d)小鼠40只，雌性，8～10周龄，均购自第一军医大学实验动物中心,并饲养在清洁实验动物中心层流仓. PE标记的抗小鼠H2DdmAb(PharMingen公司)；FITC 标记的抗大鼠MHCCLASSⅠmAb(Serotec公司)；3HTdR；60Co照射源(广东省辐照中心)；流式细胞仪；自动液闪计数器.2方法嵌合体模型的建立SD大鼠于术前5 d开始饮含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的抗生素溶液. 无菌条件下取BALB/c小鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液, SD大鼠接受8Gy全身照射(TBI)后4 h内经尾静脉输入BALB/c 小鼠骨髓细胞2×108/只,48 h后腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg［1］. 30 h后检测外周血嵌合率为%~%，证实小鼠源性骨髓已在大鼠体内植活. 取上述嵌合体SD大鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液,BALB/c小鼠肠道净化后接受9 Gy全身照射，随即经尾静脉输入上述嵌合体骨髓细胞4×107/只.实验分组以BALB/c小鼠为受鼠的A, B, C, D, E组，均接受9 Gy的TBI预处理： A组输注正常SD大鼠的骨髓细胞; B组输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞;C组为自体移植组，D组为预处理组，不输注骨髓. 以无关第3者B6小鼠为受鼠的E组输注嵌合体SD大鼠的骨髓细胞.组织病理检查出现移植物抗宿主病表现的小鼠,濒死前活杀,B组存活者于移植后第60日处死，取其肝、小肠和皮肤标本,以100 mL/L甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察. 按Thomas GVHD病理组织学分级标准判定［2］.嵌合率的测定取移植后小鼠外周血,加入FITC标记的抗大鼠MHCCLASSⅠmAb(每1×106细胞中加入1 μg),避光,4℃, 30 min. 红细胞裂解液去掉红细胞,PBS洗涤2次,流式细胞仪检测嵌合率. 皮肤移植及存活情况的观察参考文献［3］的方法,每日观察皮毛,如变硬或脱落视为移植排斥,柔软或鼠毛生长视为移植存活.混合淋巴细胞反应移植后30 d，分别取A,B组小鼠与正常BALB/c小鼠的脾细胞为反应细胞，以正常SD大鼠与Whistar大鼠脾细胞为刺激细胞，做混合淋巴细胞反应，丝裂霉素灭活刺激细胞，于96孔培养板每孔加反应细胞4×105个和刺激细胞2×105个，设自体反应孔，每组3复孔，培养96 h，终止培养前18 h，每孔加入×104 Bq，液闪计数器测定，结果用Bq值x±s表示.统计学处理：实验所得数据以x±s表示, 采用软件进行数据分析. 用KaplanMeier估计与绘制生存曲线,用方差分析比较各组脾细胞增殖程度的差异，组间多重比较用LSD法，用秩和检验分析各组移植皮片的存活期，用t检验分析外周血白细胞计数和嵌合率.2结果嵌合体模型的生存期A组在BMT后1 wk 内出现体质量下降弓背体位、活动度差、毛脏乱等典型GVHD表现，第5日开始死亡并持续下去，仅25%存活超过60 d. B组出现轻微的GVHD, %存活，与A组比较有显着性差异. C组均存活，D组均在BMT后10 d内死亡. 用KaplanMeier评估生存曲线 (Fig 1)显示嵌合体骨髓细胞的输入可显着延长存活期，GVHD发生率及严重度降低. E组也出现严重GVHD 表现，60 d时存活率仅%.移植皮肤存活情况BALB/c小鼠对特异供体SD及无关第三者Wistar皮肤的存活情况. 经秩和检验KruskalWallis H法分析，P=，经多重比较，B组BALB/c小鼠对SD大鼠皮肤移植物的存活时间比A组明显延长, 但对Wistar大鼠皮肤移植物均在2 wk内排斥，与对照组比较无显着性差异().表1BALB/c 小鼠异种皮肤移植物的存活情况混合淋巴细胞反应移植第30日A组与B 组小鼠脾细胞对供体SD大鼠脾细胞的单向混合淋巴细胞反应明显降低，经方差分析和LSD法的多重比较检验，与正常BALB/c小鼠相比， B组脾细胞增殖的抑制程度与A组有显着差别. 移植后60 d的混合淋巴细胞培养结果与30 d时一致.嵌合率测定第30日时测定嵌合体模型的外周血嵌合率，经t检验B组外周血嵌和率与A组比较无显着性差异. 但随着时间推移，嵌合率逐渐下降， A组下降幅度较大，90 d时A组仅为(±)% ，B组嵌合率仍有(±)% (,因A组死亡率高，故嵌合率的样本数较少）. B组造血恢复时间明显缩短，从第9日起外周血白细胞计数始终比A组高(Tab 3)，显示反向BMT促进受者造血的重建.表2BMT后30, 60, 90 d时A, B组小鼠外周血中大鼠源性细胞的比例表3BMT后30 d内A, B组小鼠外周血白细胞计数病理分析A,E组死亡小鼠病理学改变符合GVHD病理变化. 表现为：① 皮肤：基底细胞空泡变性、溶解坏死,大量淋巴细胞浸润；② 肝脏：肝细胞呈不同程度的变性或坏死,汇管区有较广泛淋巴细胞浸润；③ 小肠：肠黏膜水肿和出血, 部分糜烂,小肠绒毛坏死脱落. 黏膜下层淋巴细胞浸润. 病理改变属于GVHDⅡ～Ⅲ级. B组小鼠病理改变明显轻于A,E组,仅为轻度炎症反应，少量散在的肝细胞水肿变性，轻度小肠绒毛变钝，隐窝再生性改变，此为GVHDⅠ级.3讨论异种移植的排斥反应包括HAR，急性血管排斥(AVR)以及急性细胞排斥(ACXR). AVR 主要以纤维蛋白沉积、出血和血栓导致的广泛缺血缺氧和器官衰竭为特征，血管是受攻击的主要目标，在肾移植中与肾小球血栓型微血管病有关［4］. 关于ACXR发生的确切机制尚存在某些不确定因素，在灵长类动物体内，由CD4+和CD8+ T细胞共同介导抗猪的免疫反应，NK细胞也起重要的细胞毒作用，异种器官排斥期间发现有细胞性浸润［5］. 实际上,异种移植的细胞免疫反应的程度很强,现有的免疫抑制剂能抑制同种异体移植的排斥反应，但不足以控制严重的异种排斥，并且导致长期的免疫缺陷，移植物排斥和病毒复制的激活［6］；因此,许多学者认为异种移植的关键是要诱导对异种抗原的特异性免疫耐受.利用造血嵌合体诱导供者特异性的耐受被认为是避免排斥较理想的方法. 它允许供者和受者骨髓来源的树突细胞移入胸腺，代表供者和自身抗原，并诱发针对激活的T祖细胞的阴性选择，随即对同一供者来源的固体器官也产生耐受，而对第3者则排斥. Mohiuddin等［7］给大鼠11Gy致死性照射后，输注处理过的骨髓诱导小鼠→大鼠完全嵌合体模型，随后行供体特异性心脏移植，移植物存活时间明显延长. 此外，还有许多实验显示在混合嵌合体中可诱导供者器官长期存活［8-10］. 异种移植物抗宿主病是建立异种造血嵌合体的一个主要障碍，它与同种GVHD有一定的区别,主要是细胞免疫反应很强，XGVHD更为严重，异种组织和器官较同种更难植入；异种供体细胞在受者体内的浸润和分布的部位、程度与同种不同，主要分布于淋巴造血组织及供者淋巴母细胞扩增部位［11，12］.目前，关于大鼠→小鼠BMT模型的报道较多,建立稳定的嵌合体模型是诱导和维持供体特异耐受的重要途径. 我们通过反向移植嵌和体骨髓的方法先使供者对受者抗原产生特异性的免疫耐受，对受者抗原不产生免疫应答，从而突破异种间的免疫屏障，明显减轻了XGVHD的发生率及严重度，促进造血重建，并能够长时期维持较高的嵌合状态和供体特异性耐受. 这些结果证明了我们建立的异种造血嵌合体模型是成功的.【参考文献】［1］唐湘凤,李春富,裴夫瑜. 小鼠→大鼠异种移植耐受模型的建立［J］. 免疫学杂志,2003；19: 447-450.Tang XF, Li CF, Pei FY. Establishment of xenotransplantation tolerance of mouse→rat model ［J］. Immunol J, 2003；19:447-450.［2］何长民,石炳毅. 器官移植免疫学［M］. 北京: 人民军医出版社,1995：351-68.［3］孙敬方,朱德生,郝光荣,等. 实验动物学技术［M］. 北京：科技文献出版社,1997：146-148.［4］ Schuurman HJ, Cheng J, Lam T. Pathology of xenograft rejection: A commentary ［J］. Xenotransplantation, 2003;10(4):293-299.［5］ Cozzi E, Vial C, Ostlie D, et al. Maintenance triple immunosuppression with cyclosporin A, mycophenolate sodium and steroids allows prolonged survival of primate recipients of hDAF porcine renal xenografts ［J］. Xenotransplantation,2003;10: 300-310.［6］ Knosalla C, Cooper DK. Xenotransplantation and tolerance ［J］. Front Biosci, 2002;7:d1280-d1287.［7］ Mohiuddin MM, Qin Y, Qian X, et al. Longterm survival of cardiac xenografts in fully xenogeneic (mouse rat) bone marrow chimeras ［J］. Ann Thorac Surg, 2001;72(3):740-745; discussion 745-746.［8］ Drevillon C, Elian N, Zinzindohoue F, et al. Prolonged improvement of total pancreatic allograft function by previous intrathymic bone marrow cell injection in rats ［J］. Eur Surg Res,2003;35(1):1-5.［9］ van Pel M, Hilbrands L, Smits D, et al. Permanent acceptance of both cardiac and skin allografts using a mild conditioning regimen for the induction of stable mixed chimerism in mice ［J］.Transpl Immunol, 2003；11(1):57-63.［10］ Foster RD, Pham S, Li S, et al. Longterm acceptance of composite tissue allografts through mixed chimerism and CD28 blockade ［J］. Transplantation, 2003;76(6):988-994.［11］ Waer M. Mixed bone marrow chimerism across discordant xenogeneic barriers: The solution for inducing xenotransplant tolerance ［J］. Transplantation, 2000；69 (12):2482-2483.［12］ Huang Y, Ilstad ST, Neipp M, et al. Mouse xenoantigens contribute to rat Tce［ll］ V beta repertoire generation in mixed xenogeneic bone marrow chimeras ［J］. Immunology, 2000;100(3): 317-332.。

大鼠骨髓间质干细胞对同种骨髓移植后造血重建和免疫重建的作用

[收稿日期]2005-06-29 [修回日期]2005-09-29*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.30100188);广州市科技计划项目(No.2002U13E0011)资助v通讯作者Tel:87335822;E-mail:Xiangp@mail.sysu.edu.cn

[文章编号] 1000-4718(2006)06-1129-04大鼠骨髓间质干细胞对同种骨髓移植后造血重建和免疫重建的作用*

雷俊霞1,6, 郭振宇2, 赵东长3, 李红霞4, 余伟华1, 张秀明6, 郑芹1, 魏箐5, 李树浓1, 项鹏6v

(中山大学1中山医学院病理生理教研室,6干细胞中心,广东广州510080;2中山大学附属第五医院器官移植科,广东珠海519000;3广东省妇幼保健院儿科,广东广州510010;

4广州市公安局刑事科学技术研究所,广东广州510030;5中山大学附属第二医院医学中心,广东广州510120)

[摘要] 目的:探讨大鼠骨髓间质干细胞(MSC)对同种异体骨髓移植造血重建和免疫重建的影响。方法:建立大鼠同种异体骨髓移植模型,通过生存率分析、外周血象检测、免疫细胞计数和受体免疫功能检测,综合评价MSC对骨髓移植(bonemarrowtransplantation,BMT)后造血重建和免疫重建的作用。结果:(1)MSC可促进BMT后造血重建:移植后30d,共移植组外周血白细胞、淋巴细胞和血小板数均高于单纯骨髓移植组;共移植组骨髓细胞数也高于对照组。(2)MSC可促进BMT后免疫重建:移植后30d,共移植组胸腺细胞数、脾细胞总数均高于骨髓单纯移植组;共移植组对ConA、LPS刺激的淋巴细胞增殖反应以及对第三体来源的同种混合淋巴细胞反应均强于单纯BMT组。结论:大鼠MSC与骨髓共移植对同种异体骨髓移植造血重建和免疫重建有一定促进作用。[关键词] 间质干细胞;骨髓移植;造血复建;免疫复建 [中图分类号] R33818 [文献标识码] A

骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤中的定植能力的开题报告

骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤中的定植能力的
开题报告
一、研究背景
急性肝损伤常常由于药物中毒、感染、酒精、过量药物使用和外伤等因素引起，其严重程度和临床表现各不相同。

重度急性肝损伤可能会引起急性肝功能衰竭和死亡。

虽然目前有一些治疗方法，例如肝移植等，但是这些治疗方法有一些缺点，例如缺乏
捐赠的肝脏、高费用、手术后的并发症等。

因此，寻找一种有效的治疗方法是有必要的。

二、研究目的
本研究旨在探究骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤中的定植能力，为寻找一种新的治疗方法提供参考。

三、研究内容和方法
1.实验动物：选择健康的雄性Wistar大鼠，体重200～250 g。

2.建立急性肝损伤模型：采用CCL4造成急性肝损伤模型。

3.分组：将大鼠随机分为以下4组：对照组（给予CCL4）、骨髓间充质干细胞
移植组、空白负载体移植组、正常对照组。

4.移植方法：分别将骨髓间充质干细胞、空白负载体移植于急性肝损伤大鼠的门静脉。

5.取材：在移植后1、3、7、14天时分别取样，观察移植物的定植情况，包括细胞生存、增殖情况等。

6.统计学分析：对比各组动物的移植物定植情况和肝功能恢复情况，分析骨髓间充质干细胞移植对急性肝损伤的治疗效果。

四、研究意义
本研究可探究骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤治疗中的功效，并为临床提供治疗肝损伤的新方案。

大鼠同种异体后肢移植急性排斥反应的病理学研究的开题报告

大鼠同种异体后肢移植急性排斥反应的病理学研究
的开题报告
一、研究背景
肢体缺失是导致残疾的重要原因之一，而肢体移植是缓解患者痛苦，提高生活质量的重要手段。

然而，移植组织的排斥反应是移植后围绕许
多问题的主要因素之一。

在大鼠的同种异体后肢移植中，急性排斥反应
是一个常见的问题。

对这种排斥反应的研究可以为治疗移植手术后的患
者提供有价值的信息和方法。

二、研究目的
本研究旨在探究大鼠同种异体后肢移植的急性排斥反应机制，结合
病理学分析方法，为深入了解排斥反应提供实证数据。

三、研究方法
1. 实验动物：选用同种异体的SD大鼠。

2. 移植手术：选择右后肢，采用变位法将同种异体肢体移植到术后
5周的雌性大鼠。

3. 病理学检测：术后28天，选取移植部位进行病理学检测，包括炎症反应、细胞因子和组织学等方面的分析。

四、研究意义
本研究将为深入了解大鼠同种异体后肢移植急性排斥反应提供了实
验数据和病理学分析。

这些数据和分析可以作为治疗排斥反应的临床指
导和理论基础，为该领域的深入研究提供帮助。

并有望为改善患者移植
手术后的生活质量提供参考。

骨髓间充质干细胞在大鼠单肺移植后缺血再灌注损伤中的作用的开题报告

骨髓间充质干细胞在大鼠单肺移植后缺血再灌注损伤中的作用的开题报告1. 研究背景随着器官移植技术的发展，缺血再灌注损伤已成为移植组织损伤和功能障碍的主要原因之一。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一类独特的干细胞，具有广泛的生物学活性和多重细胞分化潜能，被广泛应用于组织修复和再生医学领域。

BMSCs对移植器官缺血再灌注损伤的保护作用已经引起了研究人员的高度重视。

然而，目前对BMSCs在大鼠单肺移植后缺血再灌注损伤中的具体作用及机制研究尚不明确，有必要进一步研究探索。

2. 研究目的本研究旨在探究BMSCs在大鼠单肺移植后缺血再灌注损伤中的作用及其可能的机制，为BMSCs在器官移植及缺血再灌注损伤防治中的应用提供科学依据和理论支持。

3. 研究内容和方法（1）研究内容：本研究将采用大鼠单肺移植模型，将大鼠随机分为缺血再灌注组、BMSCs组和对照组。

观察各组实验动物的存活率、肺功能指标、肺组织病理学改变及免疫组化标记变化，评价BMSCs对单肺移植后缺血再灌注损伤的保护作用。

（2）研究方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞，通过体外培养、鉴定和分化实验进一步验证细胞的纯度和生物学特性。

大鼠单肺移植实验采用左肺同种异体移植模型，BMSCs组在肺移植后24h静脉注射BMSCs，缺血再灌注组和对照组分别注射等量的生理盐水。

实验组动物于移植后6h、12h、24h、48h、72h、96h分别采集血液、组织样本进行肺功能指标检测、肺组织病理学观察及免疫组化标记检测。

4. 预期结果预计本研究可以明确BMSCs在大鼠单肺移植后缺血再灌注损伤的保护作用，并初步揭示其作用机制，为BMSCs在器官移植及缺血再灌注损伤防治中的应用提供基础研究依据。

5. 研究意义本研究结果可以为BMSCs在移植器官缺血再灌注损伤预防和治疗中的应用提供实验基础和安全性评价，有望为临床上的移植手术提供新的思路和方向，为推动现代再生医学的进步做出贡献。

应用扩增的Treg预防异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的实验研究

液、异硫氰酸荧光素（ＩＣ标记羊抗鼠Ｃ４抗体及ＦＴ）Ｄ藻红蛋白（Ｅ）记羊抗鼠Ｃ２体（国ＢｏｅｅｄＰ标Ｄ５抗美ｉｇｎｌ、ＩＣ标记羊ＩＧ同型对照及ＰｇＥ标记羊ＩＧｇ本上降低移植后ＧＨＶＤ及与ＧＤ相关的致死性并公司）ＦＴＶＨ发症是亟待解决的难题。Ｃ４Ｃ２ＤＤ５Ｔ细胞（ｒｇ是同型对照（Ｔｅ）深圳晶美公司）。其他试剂常规配制。．３群表型和功能特异的Ｔ细胞。体内能诱导免疫耐１方法在．．ｒｇ细胞清洁级Ｃ７Ｌ６小鼠，５Ｂ／受自身免疫性疾病和肿瘤治疗方面的研究发现Ｔｅ１３１分离小鼠Ｔｅｒｇ细胞对效应性Ｔ细胞有强大的抑制作用…，因此不难引颈处死，无菌取脾。ＴｉＮ４ｌｒ．ＨＣ融解红细胞，ＭＭｓＤＥ理解Ｔｅ胞在以效应性Ｔ细胞作用为主的ａｏ培养液悬浮细胞．调整细胞密度为５×１７ｍ。按ｒｇ细ｌ— ｌ０／ＬｕｅＣ４Ｃ２￣ｅｕａｒｅｏａｏＫｔｔｌｓｔｎＨＣ后ＧＨＤ的发．程中起重要的作用本研究ＭｏｓＤ＋Ｄ５ｒｇｌｏｙＴｃｌＩｌｉｉ说明书ＳＴＶ过旨在探讨扩增的Ｔｅ胞对异基因骨髓移植（ｌ．分选Ｔｅｒｇ细ａｌｏｒｇ细胞，流式细胞术检测分选前后的Ｔｅｒｇ细Ｂ）ＧＨＤ的作用。ＭＴ后ｖ胞纯度。细胞悬液经台盼蓝测定细胞活力。１材料与方法１．体外增殖Ｔｅ细胞参照文献『］验过程．２３ｒｇ２。实１１实验动物供鼠采用６周龄清洁级Ｃ７Ｌ为：用羊抗鼠Ｃ３单抗（ｇｍ）℃过夜包被９．～８５Ｂ／Ｄｅ５／Ｌ４６６Ｈ．雄性小鼠：鼠采用６～８周龄清洁级ＢＬ／（２）受ＡＢ孔圆底培养板，ＰＳ洗２遍，Ｂ每孔各加入新鲜分离的ｃＨ一雌性小鼠，受鼠全部由南方医科大学实验Ｔｅ（２）供ｒｇ细胞数为１Ｘ１，０个用完全ＲＭＩ６０液（０Ｐ４１１％动物中心提供，均为清洁级动物，饲养条件符合ＳＦＰ的ＦＳ１ｍｍ／的丙酮酸钠、０ｍｏ／Ｂ、ｏＬｉｍｌＬ的ＨＰＳＥＥ标准。实验动物质量许可证号ＳＸ粤）０６０１。ＣＫ（２０ — ０５缓冲液、ｍｌＬ的谷氨酰胺、９ｍｏＬ的精氨酸２ｍｏ／６ｍｌ／小鼠饲料和垫料均经 ∞ ｏ辐照处理，用水经高压灭及１０ＵｍＣ饮０／Ｌ的青链霉素共同配制而成）浮，悬羊抗菌处理。鼠Ｃ２Ｄ８单抗５￣／ｇｍＬ及重组鼠Ｉ一０／．每Ｌ２１０ＵｍＬ１２主要试剂和器材小鼠Ｃ４Ｃ２＋ｅｕａｒ孔终体积为２０。．Ｄ＋Ｄ５ｒｇｌｏｙｔＴ０最后加照射（０ｄ后异源性３０ａ）０ｒｃｌｉｌｔｎｋｔ（国ＭｉｅｙＢｏｃ公司）ＬＡ叮（ＡＢＣｅｌｓａｉｉ德ｏｏｈｎｉｉｅｔ、ＥＦＭＢＬ／）小鼠脾细胞作为刺激细胞，细胞数为１ × ＰｒｅｎｉｍｏｓＤ３ｕｉｄａｔｉｆ — ｕｅＣｅｍＡｂ、ＬＡＰｒｅｎｉＥｕｉｄａｔｉｆ — １。培养ｌ０个周后收获细胞备用。ｍｏｓＤ８ｍＡｕｅＣ２ｂ及ＲｅｏｉａｔｕｅＩ．（国１３３小鼠ａｌ．ＭＴ模型的建立取６～８周龄清ｃｍｂｎｎｓＬ２美Ｍｏ．．ｌＢｏＢｏｇｎｉｅｅｄ公司）ｒＧＣＦ和ｒＬ．（ｅｒＴｅ公洁级ＢＬ／健康雌性小鼠共４ｌ、ｍＭ．ＳｍＬ４ＰｐｏｅＡＢｃ０只作为受鼠，体重司）ＲＭＩ１４（国Ｇｂｏ公司）０４台盼蓝染１２。行移植术３、Ｐ６０美ｉｃ、．％８～２ｇ０只。另外１０只小鼠作为单纯照射组。移植方案参照文献『］３。１３４扩增Ｔｅ胞和Ｃ４Ｃ２一．．ｒｇ细ＤＤ５Ｔ细胞的输注基金项目：广州市科技计划资助项目（编号：０５３Ｅ３１２０Ｚ一０７）３０只行骨髓移植术小鼠分为３组：增Ｔｅ胞扩ｒｇ细作者单位：１５５广州市，５０１南方医科大学基因工程研究所（东曹移植组、Ｄ＋Ｄ５Ｔ细胞移植组和空白对照组。Ｃ４Ｃ２一分别林）５０１广州市，；１３７广东省第二人民医院血液科（陈伟，玲）王通讯作者：王玲Ｅｍａｌｇｌａｇ２．Ｏ１ — ｉ：ｚｎ＠１６ＣＩｗｌ于移植后６～８ｈ内输注０１ｍＬ纯化后的供鼠Ｔｅｒｇ

《2024年冻存神经异体移植在大鼠坐骨神经损伤修复中应用的研究》范文

《冻存神经异体移植在大鼠坐骨神经损伤修复中应用的研究》篇一一、引言随着医学技术的不断进步，神经损伤修复已成为当前研究的热点之一。

坐骨神经损伤是一种常见的神经损伤，其修复难度大，恢复效果往往不尽如人意。

近年来，冻存神经异体移植技术为坐骨神经损伤的修复提供了新的思路。

本文旨在研究冻存神经异体移植在大鼠坐骨神经损伤修复中的应用，以期为临床实践提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本实验选用健康成年SD大鼠作为实验对象，建立坐骨神经损伤模型。

所需材料包括手术器械、冻存神经异体、生理盐水等。

2. 方法（1）建立坐骨神经损伤模型：通过手术方法，对大鼠进行坐骨神经损伤。

（2）冻存神经异体准备：将健康神经组织进行冻存处理，以备后续移植使用。

（3）移植手术：将冻存神经异体移植至损伤部位，观察其生长情况及对坐骨神经功能恢复的影响。

（4）评估指标：通过行为学测试、电生理检测及组织学分析等方法，评估坐骨神经功能恢复情况。

三、实验结果1. 移植后神经生长情况冻存神经异体移植后，观察到大鼠坐骨神经损伤部位有新生神经纤维生长，且生长速度较快。

移植后4周，新生神经纤维已与宿主神经形成良好的连接。

2. 行为学测试结果通过行为学测试，发现移植后大鼠的运动功能得到显著改善，较未进行移植的对照组有明显差异。

3. 电生理检测结果电生理检测结果显示，移植后大鼠坐骨神经的传导速度和传导功能得到明显改善。

与对照组相比，移植组大鼠的神经传导功能恢复更快、更好。

4. 组织学分析结果组织学分析显示，移植后的神经组织与宿主神经组织融合良好，无明显的排斥反应。

新生神经纤维与宿主神经形成良好的连接，有助于坐骨神经功能的恢复。

四、讨论本研究表明，冻存神经异体移植在大鼠坐骨神经损伤修复中具有显著的应用价值。

通过移植冻存神经异体，可以促进坐骨神经的再生和功能恢复。

此外，该技术具有来源广泛、无免疫排斥等优点，为临床实践提供了新的思路。

然而，本研究仍存在一定局限性，如样本量较小、实验时间较短等，需进一步研究以验证其长期效果和安全性。

Sinerem标记大鼠骨髓基质细胞及移植后活体示踪研究

ｅｅｎｔｉｆｆｕｇａｔｉｏｎｆｏｌｌｏｗｉｇｎａｔｈｉｇｈｂｏｎｅｐｕｎｃｔｕｒｅ．Ｓｉｎｅｅｍ－ｒｐｏｌｙ — Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ＳＥ－ＰＬＬ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｌａｂｅｌＢＭＳＣｓ
ＹＡＮＧＺｈｉｊｕｎＩＬＵｏＹｏｎｇｃｈｕｎＩｚＨＡＮＧｌ－ｌｏｎｇｔｉａｎｌＸＵＲｌ
，ＣＨＥＮＺｈｏｎｇｃａｎｚ，ＪＩＡＮＧＸｉａｏｄａｎ２
・
论著・
Ｓｉｎｅｒｅｍ标记大鼠骨髓基质细胞及移植后活体示踪研究
杨志军罗永春 ’ 张洪钿徐如祥ｈ陈中灿姜晓丹（北京军区总医院神经外
科，北京１００００７；南方医科大学珠江医院神经外科，广东广州５１０２８２）
Ｕｎｄｅｒｈｅｔｓｔｅｉｒｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．ｔｈｅｒａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｉｌｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｂｙＨｌｅａｎｓｆｏｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔ
摘要目的
初步探索利用欣诺（Ｓｉｎｅｒｅｍ）和转染试剂体外磁性标记大鼠骨髓基质细胞这一方

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大鼠异基因骨髓移植模型的实验研究赵永;孙巧璋;丁春华;聂如琼【摘要】目的本研究拟通过全身照射,采取Y染色体标记,通过全骨髓细胞移植,建立SD大鼠性别错配异基因骨髓移植模型,并探讨建立该模型的可行性及其意义,为干细胞示踪等研究提供实验参照.方法以雄性SD大鼠为供鼠,雌性SD大鼠为受鼠,受体大鼠随机分成移植组和对照组,每组各10只.移植当天移植组和对照组大鼠均接受8.0Gy的全身照射,于照射后6h,移植组经鼠尾静脉输入2×108个/kg的雄性供鼠全骨髓细胞;对照组组注射等量的RPMI1640培养液.观察两组大鼠存活情况,检测移植组大鼠生存期外周白细胞计数,采用PCR技术检测SRY基因.结果采用8.0 Gy的全身照射为预处理方案,对照组大鼠2周内全部死亡,而移植组大鼠30d 的存活率为70％.外周血细胞计数提示全骨髓移植后造血功能恢复,且检测有雄性供鼠Y染色体出现,提示SD大鼠性别错配异基因骨髓移植成功.结论应用8.0Gy的全身照射加供体骨髓移植可成功建立Y染色体标记的同种异体大鼠嵌合体模型.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2014(036)009【总页数】3页(P1040-1042)【关键词】骨髓移植;全身照射;造血重建【作者】赵永;孙巧璋;丁春华;聂如琼【作者单位】广东省中医院,广州510000;广东省中医院,广州510000;广东省中医院,广州510000;中山大学孙逸仙纪念医院,广州510000【正文语种】中文【中图分类】R392.4为了监测骨髓干细胞在体内的存活、迁移、增殖及分化，需要有效的标记方法对这些细胞进行示踪。

Y染色体标记的最大优点为操作简单。

本研究拟通过全身照射，采用Y染色体标记，探讨建立SD大鼠性别错配异基因骨髓移植模型的可能性及其意义，为进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物清洁级雌性SD大鼠(20只，体重250～280g)为受鼠，清洁级雄性SD大鼠(24只，体重120～150g)为供鼠，提供全骨髓细胞，大鼠均由中山大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养液(美国Invitrogen公司)，DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA marker(Takara公司)，琼脂糖、电泳缓冲液(TBE)、胶体金、PBS缓冲液。

戊巴比妥钠(德国Merck公司)，红细胞裂解液(美国Sigma公司)。

1.1.3 仪器显微外科手术器械1套，200目金属网，自制30cm×25cm×8cm有机玻璃盒1个，HD型直线加速器(荷兰PHILIP公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，台式高速离心机(德国Eppendorf公司)，恒温水浴箱(美国Sheldon公司)，凝胶成像仪，电泳板及电泳槽，PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 实验方法1.2.1 供鼠全骨髓细胞制备移植当天将24只雄性SD大鼠采用颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离双侧股骨、胫骨，剪开两端骨骺，用5mL注射器吸取RPMI1640培养液反复冲洗髓腔，将冲出的所有供鼠骨髓细胞合并后通过200目金属网形成单细胞悬液，离心后去上清，加入红细胞裂解液，用不含血清的RPMI 1640培养液反复洗涤3次，行细胞计数并调成所需细胞浓度(1×108·mL-1)备用。

1.2.2 受鼠的饲养条件及术前准备受鼠饲养于SPF级动物房，每周以有效氯消毒1次；木屑垫料均经高压消毒，每周更换2次；所用饲料经Co60照射消毒。

在移植前3d开始饮用含红霉素(250mg·L-1)和庆大霉素(320mg·L-1)的饮用水进行肠道清洁，并持续至移植后2周。

1.2.3 受鼠移植过程 20只雌性受鼠于移植当天置于30cm×25cm×8cm有机玻璃盒内，接受8.0Gy的全身照射(total body irradiation，TBI)，剂量率为0.7 Gy·min-1。

照射6h后，将受鼠随机分为两组：移植组10只，经鼠尾静脉输入2×108个/kg的雄性供鼠全骨髓细胞；对照组10只，注射等量的RPMI 1640培养液。

1.3 观察指标①观察大鼠的存活情况，有无腹泻、体重下降、翘毛及活动度下降等表现；②随机抽取移植组大鼠5只，断尾采集移植前及移植后7、30d外周血，分析血象变化。

1.4 PCR法检测外周血SRY基因移植组生存30d的大鼠断尾取血，提取DNA，PCR检测供鼠来源的Y染色体上SRY基因。

Y染色体SRY基因DNA片段的引物为[1]：上游引物5‘-catctctgacttcctggttgcaa-3’，下游引物5‘-atgctgggattctgttgagcc-3’(由Takara公司合成)，扩增产物长度为241bp。

SRY PCR反应体系:10×PCR Buffer 5μL，dNTP mix 8μL，上、下游引物SRY 各1μL,Tag酶0.25μL，模板DNA 1μL，补足灭菌去离子水至总体积50μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 30s，59 ℃ 30s，72 ℃ 60s；扩增30个循环，72 ℃延伸8 min。

正常雄性大鼠外周血为阳性对照，正常雌性大鼠外周血为阴性对照。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下观察、拍照。

1.5 统计学方法采用SPSS 13．0软件对数据进行分析。

计量资料用表示，组间比较用单因素方差分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 两组大鼠生存情况对照组大鼠骨髓细胞移植2d后开始出现进食水明显减少，弓背翘毛，对外界刺激明显减弱，2周内全部死亡。

移植组大鼠也出现上述症状，30d存活率为70%(7/10)。

2.2 外周血细胞计数变化移植组大鼠照射后7d的外周血白细胞总数(WBC)、血小板(PLT)均低于照射前和照射后30d(P<0.05)，红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)无明显变化，见表1。

表1 移植组大鼠外周血检测结果WBC/(×109·L-1)RBC/(×1012·L-1)HGB/(g·L-1)PLT/(×109·L-1)照射前6．4±0．5∗6．8±1．3143．0±11．4460．0±11．5∗照射后7d1．1±0．45．4±1．2123．4±14．248．2±10．2 照射后30d6．0±0．8∗6．3±1．0131．8±10．0443．4±17．7∗ F值110．71．73．41484．7 P值0．00．20．70．0与照射后7d比较*P<0.052.3 植入依据移植组移植后30d存活大鼠取外周血，提取DNA，PCR检测到性别决定基因SRY(图1)。

M：DNA marker； 1：雄性SD大鼠(阳性对照)；2：雌性SD大鼠(阴性对照)；3：骨髓移植SD大鼠图1 外周血SRY基因PCR电泳图3 讨论为了监测骨髓干细胞在体内的存活、迁移及增殖、分化，需要有效的标记方法对这些细胞示踪。

当前常用的标记方法有：①转基因：遗传性地改变细胞的基因，使其表达特异性的标志物，如绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal、LacZ)等[2-3]；②Y染色体标记[1,4]；③特定的荧光染料标记细胞：如DAPI、PKH26、CFSE 等；④核酸标记物：5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)或氚标记去氧胸腺嘧啶核苷来标记正在分裂的细胞；⑤超顺磁氧化铁标记细胞：在磁共振(MR)成像上来检测移植细胞在宿主体内的分布、迁移和分化情况[5]。

在上述标记技术中,Y染色体标记方法操作较简单。

Sinclair等[6]揭示在哺乳动物包括人类的Y染色体短臂上存在着决定性别的主宰基因(sex-determining regin of the Y)。

本实验就是利用Y染色体的这种特异性PCR技术，鉴定性别错配异基因骨髓移植成功与否。

根据相关研究报道[2,4]，本文实验采用8.0 Gy的TBI为预处理方案，对照组大鼠均死亡，提示采用TBI预处理是简便可行的，可以为移植清空骨髓龛，利于供者细胞植入。

移植组除接受移植外,其余条件与对照组相同，故外周血象变化及生存的差异是由移植引起。

而移植组大鼠造血恢复，且检测有供鼠Y染色体的出现，提示骨髓细胞移植成功。

总之，通过上述方法，成功地建立了大鼠嵌合体的动物模型，为今后干细胞示踪、移植物抗宿主病等研究提供了有益尝试。

【相关文献】[1] Wei Y,Nie Y,Lai J,et parison of the population capacity of hematopoietic and mesenchymal stem cells in experimental colitis rat model[J].Transplantation,2009,88(1):42-48.[2] Sata M,Saiura A,Kunisato A,et al.Hematopoietic stem cells differentiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Nat Med,2002,8(4):403-409. [3] Tanaka K,Sata M,Hirata Y,et al.Diverse contribution of bone marrow cells to neointimal hyperplasia after mechanical vascular injuries[J].Circ Res,2003,93(8):783-790.[4] Han CI,Campbell GR,Campbell JH.Circulating Bone Marrow Cells Can Contribute toNeointimal Formation[J].J Vasc Res,2001,38(2):113-119.[5] Ma GS,Qi CM,Liu NF,et al.Efficiently tracking of stem cells in vivo using different kinds of superparamagnetic iron oxide in swine with myocardial infarction[J].Chin Med J (Engl),2011,124(8):1199-1204.[6] Sinclair AH,Berm P,Palmer MS,et al.A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to conserved DNA-bindingmetif[J].Nature,1990,346(6281):240-244.。