应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态性
MTHFR基因A1298C多态性与肠癌遗传易感相关性研究
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［ ］ 赵春华 ， ８ 曲凡 ， 赵春光 ， Ａ ２ ３淋 巴瘤 Ｒ ｊ细胞 抑制效应 及 等． ｓ０ ａ ｉ 其 Ｉ 基 因表 达 的 影 响 ［ ］ 中华 肿 瘤 防 治杂 志 ， ００，７ Ｊ． ２ １ １
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211149167_琼海地区高危妊娠风险人群叶酸代谢障碍相关基因筛查及叶酸服用效果
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DOI:
10.
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T),导 致 MTHFR
MTHFR基因检测指导男性不育个体化用药-2014.8.30
MTHFR基因检测指导男性不育个体化用药全世界约有15%的育龄夫妇不育，其中约50%是由男方原因造成的。
男性不育病因呈多样性与复杂性，遗传因素对男性不育的影响一直是男性不育领域研究的热点，叶酸代谢是研究的重点点。
叶酸在体内合成及代谢所涉及到的酶主要1有亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) 、蛋氨酸合成酶(MTR) 、蛋氨酸合成还原酶(MTRR) 、胱硫醚合酶(CBS)。
这些酶的编码基因上存在众多的单核苷酸多态性，基因调控区和编码区的单核苷酸多态性可能会通过改变酶活性而影响叶酸、同型半胱氨酸（Hcy）在体内的合成，影响DNA的合成和DNA的甲基化,从而影响精子密度与活力2。
中国汉族人群中CC型频率为25.9%，CT型频率为44.9%，TT型频率为29.2%3，对8 篇文献中M THFR 基因677位点C→T和1298位点A→C的Meta 分析结果表明,MTHFR 基因C677T与生精功能下降显著相关(OR = 1. 39, 95%C I: 1. 1522. 69, P = 0. 000 6) 。
通过对2001至2009年共24篇男性不育相关文献中2275 名不育症患者和1958名健康男性的MTHFR基因677位点多态性与健康状态的统计分析，发现：MTHFR基因是亚洲男性不育的易感基因，亚洲男性MTHFR基因TT/CT型不育的风险是CC型的1.42倍；MTHFR基因TT/CT基因型男性精子缺乏的风险是CC型的1.55倍4。
伊朗研究者对伊朗164名不育成年男性和328名健康男性MTHFR (C677T, A1298C, G1793A)基因多态性分布进行研究。
发现血清叶酸浓度与精子参数呈正相关，同型半胱氨酸水平与精子参数呈负相关。
患者组MTHFR 基因677位点T出现的频率高于对照组2.41倍，说明MTHFR C677T 基因多态性增加男性不育风险5。
Bingbing Wei在亚洲人群证明，MTHFR C677T 非A1298C起精子密度下降主要作用，其后多项meta分析证明了MTHFR基因C677T 多态性造成男性无精、精子密度下降678。
妊娠期高血压疾病患者MTHFR基因多态性及血浆同型半胱氨酸水平分析
妊娠期高血压疾病患者ＭＴＨＦＲ基因多态性及血浆同型半胱氨酸水平分析吴 云，许华文，陈建文，王浩强，何春微，李 桂（海南现代妇女儿童医院检验科，海南海口５７０２０３）ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．０９．０２４收稿日期：２０２０ ０４ １２；修回日期：２０２０ ０６ ０１通讯作者：吴云（１９８４—），学士，主管技师。
研究方向为医学检验。
Ｅ ｍａｉｌ：１８２１９８２４７＠ｑｑ．ｃｏｍ摘要：目的 探讨妊娠期高血压疾病（ＰＩＨ）患者亚甲基四氢叶酸还原酶（ＭＴＨＦＲ）基因Ｃ６７７Ｔ和Ａ１２９８Ｃ的多态性特点及其与血浆同型半胱氨酸（Ｈｃｙ）水平的相关性。
方法 选取２０１５年３月至２０１８年１１月于海南现代妇女儿童医院产科进行产检并完整随访的孕产妇共２０２８例，应用ＰＣＲ ＲＦＬＰ方法检测ＭＴＨＦＲ基因Ｃ６７７Ｔ和Ａ１２９８Ｃ多态性，采用酶循环法检测血浆Ｈｃｙ水平，比较不同组别ＭＴＨＦＲ基因型分布及血浆Ｈｃｙ水平差异。
结果 病例组和对照组Ｃ６７７Ｔ基因型分布差异具有统计学意义（χ２＝５４．４９０，Ｐ＜０．００１），病例组ＣＴ型及ＴＴ型所占比例高于对照组（χ２＝４４．８００，Ｐ＜０．００１；χ２＝４．０６９，Ｐ＝０．０４４），Ｔ等位基因频率显著高于对照组（χ２＝２４．３００，Ｐ＜０．００１）。
伴蛋白尿组和不伴蛋白尿组之间ＭＴＨＦＲ基因Ｃ６７７Ｔ位点分布差异具有统计学意义（χ２＝７．７７４，Ｐ＝０．０２１），伴蛋白尿组ＴＴ型患者比例增高（χ２＝４．４８５，Ｐ＝０．０３４），Ｔ基因频率显著增高（χ２＝８．１０９，Ｐ＝０．００４）。
病例组和对照组Ａ１２９８Ｃ基因型分布、Ａ／Ｃ等位基因频率分布差异均未发现统计学意义（χ２＝０．７８９，Ｐ＝０．６７４；χ２＝０．１３７，Ｐ＝０．７１２）。
病例组总体平均Ｈｃｙ水平及各基因型的平均Ｈｃｙ水平均显著高于对照组（Ｐ＜０．００１），Ｃ６７７Ｔ基因ＴＴ型Ｈｃｙ水平较ＣＣ型和ＣＴ型高，但差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。
叶酸代谢通路常见基因多态位点及其检测方法
ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｂｉｒｔｈ ｄｅｆｅｃｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｏｓｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｗｉｌｌ ｂｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ
ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ５ １０⁃ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
关键词： ５，１０⁃亚甲基四氢叶酸还原酶； 甲硫氨酸合成酶还原酶； 单核苷酸多态性；基因分型
中图分类号： Ｑ７８ 文献标志码： Ａ 文章编号： ２０９６⁃３６５３（２０２０）０３⁃０４４０⁃０６
ＤＯＩ： １０．１６８０９ ／ ｊ．ｃｎｋｉ．２０９６－３６５３．２０２００２１５０１
Ｃｏｍｍｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆｏｌａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｔｈｅ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｔｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅ ｆｏｌａｔｅ ｃａｎ ｇｕｉｄｅ ｔｈｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｏｆ
ｆｏｌａｔｅ ｐｒｅｖｅｎｔ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ
用体外 表 达 的 酶 进 行 研 究 表 明， 相 较 于 野 生 型 酶，
苷酸多态位点，它们对叶酸代谢关键酶的活性影响很大，可以导致叶酸代谢障碍，血液中同型半胱氨酸
水平升高，与新生儿出生缺陷、不孕不育、心脑血管疾病、癌症等多种疾病发病风险的提高密切相关。 检
广东地区汉族育龄妇女 mthfr 基因遗传多态性
ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６ ａｎｄ Ｊｕｌｙ ２０１８ ｗｅｒｅ ｅｎｒｏｌｌｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃ６７７Ｔ ａｎｄ
何天文１，２，黄演林１，２，丁红珂 ，１ ２，张彦１，２，张艳霞１，２，姚翠泽 ，１ ２，杜丽１，２，尹爱华 （，１ ２ １．广东省妇幼保健院医学遗 传中心，广州 ５１１４４２；２．广东省妇幼代谢与遗传病重点实验室，广州 ） ５１１４４２
摘要：目的 调查并分析广东地区汉族育龄妇女 ＭＴＨＦＲ 基因多态性分布情况。方法 选取 ２０１６ 年 １ 月至 ２０１８ 年 ７ 月广东 省妇幼保健院行婚检／ 孕检的育龄妇女 １３ ３３６ 例，采用 ＴａｑｍａｎＭＧＢ 法测定 ＭＴＨＦＲ 基因 、 Ｃ６７７Ｔ Ａ１２９８Ｃ 位点的基因型，并采 用卡方检验比较本地人群与其他人群的基因型频率／ 等位基因频率的分布情况。结果 ＭＴＨＦＲ 基因 Ｃ６６７Ｔ 位点野生型 （ＣＣ）、杂合突变型（ＣＴ）和纯合突变型（ＴＴ）分别占 、 ５１．５％ ３８．７％和 ９．８％，突变 Ｔ 基因频率为 ２９． ； ２％ ＭＴＨＦＲ 基因 Ａ１２９８Ｃ 位 点中，野生型（ＡＡ）、杂合突变型（ＡＣ）和纯合突变型（ＣＣ）分别占 、 和 ５９．３％ ３５．２％ ５．５％，突变 Ｃ 基因频率为 ２３．１％。广东地区 汉族育龄妇女 ＭＴＨＦＲ 基因 、 Ｃ６７７Ｔ Ａ１２９８Ｃ 位点基因型分布和等位基因频率分布与全国人群比较差异均有统计学意义（Ｐ＜ ０．０１）。广东地区汉族育龄妇女 ＭＴＨＦＲ 基因 、 Ｃ６７７Ｔ Ａ１２９８Ｃ 位点的基因频率和等位基因频率与江苏、九江、齐齐哈尔和长沙 等地区汉族育龄妇女人群相比差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。广东地区汉族育龄妇女 ＭＴＨＦＲ 基因 、 Ｃ６７７Ｔ Ａ１２９８Ｃ 位点的 等位基因频率与亚洲、东亚、南亚、欧洲、美洲地区人群等位基因频率的分布存在不同程度的差异。结论 广东地区人群 ＭＴＨＦＲ 基因的多态性分布与其他地区相比存在明显的差异。 关键词：育龄妇女；亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性 中图分类号：Ｒ４４６ 文献标志码：Ａ
重型抑郁症患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测
重型抑郁症患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测冯磊光;邵春青;刘英慧;陶永红;郝潇蕾【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2010(030)008【摘要】目的探讨北方汉族人群5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与重型抑郁症的关系.方法采用病例-对照研究.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测MTHFR C677T及A1298C基因多态性.结果 (1)对照组677TT基因型频率及T等位基因频率分别为13.16%和39.80%;1298CC基因型和C等位基因频率分别为1.32%和12.83%;(2)抑郁症组MTHFR 677TT基因型频率(35.53%)明显高于正常对照组(13.16%)(P<0.001),677 T等位基因频率(57.24%)明显高于对照组(39.80%)(P<0.001).(3)Logistic回归分析,C677T基因型与疾病的发生有关(P<0.001).结论 MTHFR C677T基因变异与本组重症抑郁症发病有关,是其发病的危险因素;MTHFR A1298C基因变异与本组重症抑郁症发病无关联.【总页数】4页(P811-814)【作者】冯磊光;邵春青;刘英慧;陶永红;郝潇蕾【作者单位】哈尔滨医科大学,附属第一医院,检验科,黑龙江,哈尔滨,150001;北京市天坛医院,检验科,北京,100700;哈尔滨医科大学,附属第一医院,检验科,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨医科大学,附属第一医院精神科,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨医科大学,附属第一医院,检验科,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】R749.3【相关文献】1.青年脑梗死患者同型半胱氨酸、5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测 [J], 高娟;孙亚菲;李永乐;苏立凯;郭力2.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性荧光PCR检测方法的建立与应用 [J], 刘秀卿; 李延武; 李卓成3.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测对先兆流产孕妇的临床价值 [J], 陈跃4.亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测在育龄人群中的临床价值 [J], 杨康;朱巧玲;周少雄;庄锡伟;彭健桥;欧阳佩雯5.亚甲基四氢叶酸还原酶A1298C基因多态性检测在高同型半胱氨酸血症治疗中的价值 [J], 徐炳欣;赵艳;段淑娟;居春阳;于洋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
1338例孕前育龄妇女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突变结果分析
1338例孕前育龄妇女MTHFRC677T、A1298C、MTRRA66G基因突变结果分析作者：黄卫彤覃卫娟李筱瑜来源：《中国现代医生》2019年第13期[摘要] 目的探讨孕前育龄妇女亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T、A1298C基因和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G基因检测在出生缺陷防控技术应用中的价值。
方法选择2015年1月～2016年12月在我院做孕前检查的1338例育龄妇女为研究对象，抽取靜脉血，提取全血中的DNA，使用荧光定量PCR法进行检测MTHFR C677T、A1298C基因突变位点和MTRR ;A66G基因突变位点，分析基因频率分布情况。
结果 1338例孕前育龄妇女的MTHFR C677T位点CC、CT、TT基因型频率分布分别为58.6%、35.0%、6.4%;MTHFR基因A1298C位点AA、AC、CC基因型频率分布分别为62.5%、30.0%、7.5%; MTRR基因A66G 位点AA、AG、GG基因型频率分布分别为53.1%、39.8%、7.1%。
MTHFR C677T位点基因型频率分布与佛山、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较，有显著差异（χ2=189.81、663.24、791.40、99.09、712.34，P<0.05）;MTHFR A1298C位点基因型频率分布与佛山、珠海、郑州、长春、九江、江苏研究结果比较有显著差异（χ2=45.33、20.21、60.92、103.24、22.83、84.56，P<0.05）;MTRR A66G位点基因型频率分布与郑州、长春研究结果比较有显著差异（χ2=7.290、6.432，P<0.05），而与佛山、珠海、九江、江苏研究结果比较无显著差异（χ2=3.500、0.534、0.537/3.351，P>0.05）。
结论南宁市孕前育龄妇女MTHFRC677T TT、A1298C CC、MTRRA66G GG基因型频率分布大致一致，但与国内其他地区比较MTHFRC677T、A1298C和MTRR A66G位点基因型频率分布有地域性差异。
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应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态
性
目的探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。
方法提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA，用TaqMan探针技术对MTHFR 基因的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。
结果43例样本的MTHFR C677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC，两种分型方法结果一致。
结论本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，能够用于MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点分析。
标签：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌
胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。
近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。
亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA 的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。
MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。
MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。
因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。
现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。
不适宜用于临床检测。
本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C 两个多态性位点进行分型。
1资料与方法
1.1一般资料经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。
采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。
1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。
MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，
对应样本基因突变位点T。
MTHFR A1298C一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基T，对应样本基因突变位点A。
探针序列，见表1。
MTHFR C677T及A1298C多态性real-time PCR采用25 μL反应体系：40×SNP Genotyping Assay Mix：0.625μL；TaqMan 2×PCR Master Mix：12.5 μL；DNA模板：1 μL；dd H2O：10.875 μL。
探针检测在BIO-RAD IQ5实时荧光PCR 仪上进行。
反应条件为：95℃预变性10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，共40个循环。
由于仪器的限制，本研究使用的BIO-RAD IQ5实时荧光PCR仪中没有VIC荧光检测通道，我们选择了HEX荧光通道替代，两种荧光相差1nm波长。
1.3 DNA测序法验证TaqMan探针技术检测MTHFR基因多态性
1.3.1目的片段的扩增设计MTHFR C677T及A1298C两个多态性位点的测序引物（Invitrogen公司合成），引物序列，见表2。
2结果
2.1 Taqman探针基因型分析MTHFR C677T和A1298C real-time PCR散点图基因分型结果分别，见图1、图2。
2.2 DNA测序验证采用Lansergene SeqMan软件分析测序结果。
2.3 MTHFR基因多态性分型结果43例样本MTHFR C677T基因型分别为野生纯合型CC 14例（32.5%）、突变杂合型CT 23例（5
3.5%）及突变纯合型TT 6例（1
4.0%）。
A1298C基因型分别为AA 24例（5
5.8%）、AC 18例（41.9%）、CC 1例（2.3%）。
本研究中，TaqMan探针技术检测及DNA测序验证，两种检测方法得到的基因分型结果一致。
3讨论
中国是个胃癌高发的国家，每年新发病例数占全球总数的40%。
胃癌化疗方案众多且无标准方案，目前临床应用最广泛的是基于氟尿嘧啶类药物的化疗方案，在实际的化疗过程中，氟尿嘧啶类药物的个体差异较大，氟尿嘧啶类药物在体内均需转化为5-FU，继而发挥抗肿瘤作用。
MTHFR是5-FU代谢中的一个关键酶，5-FU的活性代谢产物还原型叶酸（CH2FH4）在MTHFR的作用下转变为5-甲基四氢叶酸，使CH2FH4与胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TS）、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷（FdUTP）组成的三元复合物减少，从而削弱5-FU的抗肿瘤作用。
C677T突变产生丙氨酸被缬氨酸取代的错义突变，其合成的蛋白质会出现热稳定性降低和酶活性的改变[4]。
有研究提出，MTHFR基因的C677T多态性通过影响DNA甲基化和核酸稳定性，参与了胃癌的发生。
A1298C突变使得编码后谷氨酰胺被丙氨酸替代，有报道称[5]纯合子突变型可使酶活性降低到正常值的60%左右。
因此，测定MTHFR的基因型对肿瘤患者的个体化用药具有至关重
要的意义。
但是，常规实验室多应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的方法检测MTHFR的基因多态性，该方法需要用凝胶电泳对扩增产物进行分析，易造成样本间污染，影响结果判读。
TaqMan探针技术省时、简单、准确、安全、实时分析是它突出的优点[6]。
同时，TaqMan探针在闭合单管中进行检测，避免了由样本间污染造成假阳性的结果[7]。
在我们的研究中，为了进一步验证TaqMan方法的准确性，我们进行了DNA 测序验证，与TaqMan探针基因分型结果相比较，发现结果完全一致。
本研究采用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，故我们认为使用TaqMan技术为MTHFR C677T及A1298C基因多态性分型可用于临床检测。
TaqMan探针基因检测法具有很好的临床实用性，是临床快速诊断MTHFR基因型较有价值的方法。
参考文献：
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[3]Etienne M C，Formento J L，Chazal M，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and response to fluorouracil-based treatment in advanced colorectal cancer patients[J].Pharmacogenetics.2004，14（12）：785-792.
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