基因分型技术
一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法为了促进斑马鱼的高通量的
一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法为了促进斑马鱼的高通量的基因分型，我们开发了一种新的技术——用高通量熔解分析（HRMA）区分野生、杂合、纯合突变。
这种耗时一个小时的技术不需要进行限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳的操作。
此技术生成的熔解图的敏感性高，可以检测不明确的PCR产物。
我们可以对斑马鱼的三种类型的突变进行可靠的基因分型，包括apc hu745（apc mcr）和p53zy7（p531166T ），小的缺失突变（bap28y75）及逆转录病毒的插入突变（wdr43hi821a）。
这种技术可对单个斑马鱼胚胎及个体进行基因分型并适用于其它类型的生物体。
Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009©2009 Wiley-Liss，Inc。
关键词：熔解曲线斑马鱼基因分型 SNP 点突变插入突变简介斑马鱼作为有机体遗传模型正在成熟。
考虑到比较容易维持大量的突变线，且大量的鱼位于每个突变线，大规模的基因分型需要有效的高通量的基因分型技术。
突变的多种类型导致斑马鱼突变，增加了基因分型的复杂性。
ENU诱变剂——诱导斑马鱼突变的主要物质，经常导致单个碱基的突变，小的缺失插入也会发生。
第二种比较普遍的方式是插入诱变，用逆转录病毒插入或转座因子插入破坏基因。
因此，有效的基因分型这些突变类型的方法是必须的。
提供一种更快、有效、令人满意的基因分型方法，有100%的精确度。
寻找高通量的技术/方法，去除掉比较浪费时间的步骤。
随着扩增基因组DNA 的PCR技术的出现，典型的基因分型技术包括Southern印迹法和放射性方法（RFLP和SSCP）已经逐渐被淘汰。
一些基于PCR 的方法用于偶然产生或消除限制性内切点的突变。
大多数方法，除了测序方法之外，需要用PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳。
当数百个或成千上万个样品需要基因分型时，这项工作就变得浪费时间且费用较高。
对于产生或消除一个特殊的限制性位点的突变而言，以PCR为基础的限制性片段长度多态性（RFLP）是一种有用的技术。
多重pcr技术的科研应用
多重pcr技术的科研应用多重PCR技术是一种在同一个反应中能够检测多个目标基因或DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）技术。
由于其高效、快速和经济的特性，多重PCR 技术在科研领域中有广泛的应用。
以下是一些多重PCR技术在科研中的应用：1. 基因分型：多重PCR技术被广泛应用于基因分型研究中，如人类基因组中的单核苷酸多态性（SNP）分型、细菌的菌株鉴定等。
通过一次PCR反应可以检测多个基因位点，提高了分型的准确性和速度。
2. 基因表达分析：多重PCR技术可以用于检测不同组织或不同处理条件下多个基因的表达水平。
通过一次实验就可以检测多个基因的表达，节省了实验时间和成本。
3. 突变检测：多重PCR技术可以用于检测基因突变，如点突变、插入或缺失等。
这种技术可以同时检测多个位点，提高突变检测的灵敏度和特异性。
4. 病原体检测：多重PCR技术可以用于检测和鉴定病原体，如细菌、病毒、寄生虫等。
这种技术可以在一次实验中检测多种病原体，为疾病的诊断和治疗提供快速和准确的信息。
5. 进化生物学研究：多重PCR技术被用于研究物种的进化关系和系统发生学。
通过同时比较多个基因的序列，可以更准确地评估物种之间的亲缘关系和演化历程。
6. 法医学应用：多重PCR技术在法医学中有广泛的应用，如DNA指纹图谱分析、亲子鉴定、个体识别等。
通过一次PCR反应可以检测多个DNA标记，提高了个体识别和亲子鉴定的准确性。
总之，多重PCR技术在科研领域中的应用非常广泛，涵盖了基因组学、遗传学、生物化学、生物信息学等多个学科。
随着技术的不断进步和应用研究的深入，多重PCR技术的应用将更加广泛和深入。
SNP分型技术简介
SNP概念
SNP（single nucleotide polymorphisms ）单核苷酸多态性
是指在基因组水平上由单个核苷酸的改变所引起的DNA 序列多态性。
单 个 ？ 核苷酸 ？ 多态性 ？
突变 与 多态性
1. 多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以 上。否则就叫突变（小于1%）。 2. SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。 3. SNP一般来说，是全部体细胞一样的基因型。 4. 突变一般不是一个个体全部体细胞的变化。 5. 如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突 变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系；达到 了1%就是多态性了。
编码区snp有同义和非同义2种非同义突变由于会导致氨基酸的变化从而影响蛋白质的功能特别是发生在结构功能区域的snp尤其重要非同义突变虽然没有明显的功能的分子机制但是在遗传学上可能因为与附近的其它致病基因的表达或者snp连锁因此在流行病学上形成阳性结果一般以此解释
SNP分型简介
单核苷酸多态性分型 SNP技术交流QQ群：107750067
SNP研究的优势 1. SNP在基因组中每500-1000个碱基就有一个标记。无论是比 较于RFLP还是SSR（6000一个标记），都要广泛得多； 2. SNP在人群中是等位基因性的，在任何人群中其等位基因 频率都可估计出来； 3. 与微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码 区的SNP，而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出 现困难； 4. 部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构 或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制 的候选位点； 5. 易于自动化、规模化分析，缩短了研究时间。
公开的SNP 数据库：
snp芯片的原理及应用
SNP芯片的原理及应用1. 引言单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是基因组中最常见的变异形式，它在人类疾病的研究中起着重要的作用。
SNP芯片是一种高通量基因分型技术，可以用来检测个体基因组中的上万个SNP位点。
本文将介绍SNP芯片的原理以及其在各个领域的应用。
2. SNP芯片的原理SNP芯片是一种将DNA序列多态性引入到DNA芯片上的高通量基因分型工具。
其基本原理如下：1.选择SNP位点：根据研究目的和基因组数据库的数据，选择与感兴趣的生物学过程或疾病相关的SNP位点。
2.设计引物：根据选择的SNP位点序列设计引物，通常采用探针杂交的方式。
引物的设计需要考虑SNP的位点和碱基对应情况。
3.制备芯片：将设计好的引物固定在芯片表面上，并将每个SNP位点的引物排列成阵列状，以便同时检测多个SNP位点。
4.样品准备：从被检测的个体中提取DNA样品，并使用PCR扩增目标SNP位点的DNA片段。
5.杂交：将扩增好的DNA样品加入到芯片上，利用引物与样品中相应DNA片段的互补序列形成特异性的杂交。
6.洗涤：通过洗涤过程去除未结合的DNA片段，使只有与芯片上相应引物杂交的DNA片段留在芯片上。
7.形成芯片图像：利用特定的扫描仪扫描芯片，根据芯片上不同位置的荧光信号强度来分析每个SNP位点上的基因型。
3. SNP芯片的应用SNP芯片在各个领域的应用非常广泛，下面列举了几个典型的应用示例：3.1. 人类遗传疾病研究SNP芯片在人类遗传疾病研究中发挥着重要作用。
通过比较病例组和对照组的SNP芯片数据，可以发现与疾病相关的SNP位点，进而研究疾病的致病机制和发展规律。
例如，在癌症研究中，SNP芯片常用于寻找与癌症发生和进展相关的遗传变异。
3.2. 农业育种SNP芯片在农业育种中的应用越来越广泛。
农业科学家可以利用SNP芯片分析大量的植物或动物个体，筛选出具有优良基因型的品种或个体，从而加快优质农产品的培育速度。
基因分型技术在人群遗传多样性研究中的应用
基因分型技术在人群遗传多样性研究中的应用人类是一个复杂而多样化的物种，每个人的基因组都有着独一无二的遗传信息。
基因分型技术是一种基于DNA序列的研究方法，可以帮助我们深入了解人类基因组的多样性及其与健康、疾病等相关的关系。
一、基因分型技术的基本原理基因分型技术主要基于PCR扩增、电泳、测序等方式从DNA中提取并分析特定的区域，从而得到个体的遗传信息。
常用的基因分型技术包括STR、SNP、HLA 等。
其中，STR技术是通过检测DNA序列中短重复序列（Short Tandem Repeats，STR）的数量与长度的差异进行个体遗传信息的分析。
根据不同的峰图，可以区分出不同的基因型，实现个体的DNA鉴定、亲子关系分析等。
SNP技术是通过检测基因组中单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的位点进行分型，用于研究遗传性疾病、药物反应性差异等。
HLA技术是检测人体组织相容性抗原（Human Leukocyte Antigen，HLA）基因的类型和亚型，用于移植医学及自身免疫疾病研究。
二、基因分型技术在人群遗传多样性研究中的应用基因分型技术可以帮助我们了解人类基因组的遗传多样性，从而为疾病预防、治疗、药物研发等方面提供科学依据。
通过对全球不同人群的基因分型数据的比较分析，可以探究人类群体间的遗传联系，揭示人类起源与迁徙史。
1. 遗传多样性研究人类有着丰富的遗传多样性，其存在与种群的演化、适应性等密切相关。
通过基因分型技术，可以分析人群的遗传多样性，包括基因型频率、基因亚型、等位基因频率等，以及其与遗传疾病、药物反应等之间的关系。
例如，中华民族的HLA多态性研究表明，汉族与少数民族的HLA基因型分布不同，不同群体间存在着较大的HLA遗传多样性；而不同的HLA基因型可能与肿瘤、自身免疫病等疾病的易感性相关。
2. 族群起源与迁徙史研究不同人群的基因组有着丰富的多样性，可以被用来推断人类的起源与迁徙史。
MLVA分型技术和实验操作步骤
MLVA分型技术和实验操作步骤MLVA（多重定量PCR分型技术）是一种基于多重PCR扩增的分型技术，它可以用来对细菌进行分型和鉴定，并用于疫情的追踪和溯源。
下面是MLVA分型技术的实验操作步骤：1.提取细菌基因组DNA：从细菌菌落或液体培养物中提取基因组DNA。
可以使用商业化的基因组DNA提取试剂盒来进行提取，按照说明书中的步骤进行操作。
2.设计引物和预扩增：根据待测菌株的基因组序列，设计适用于目标DNA片段的引物。
引物应该选择在基因组中具有高度保守性的区域，以确保反应的特异性。
将设计好的引物与提取到的DNA进行预扩增。
预扩增是将样品中的目标片段DNA扩增到足够的浓度，以确保后续的扩增反应。
3. MLVA引物的选择：根据待测菌株基因组中的微卫星重复序列，设计MLVA引物。
微卫星重复序列（也称作SSR或简单重复序列）是一种相对较短（1-6bp）的DNA序列，在基因组中重复出现。
这些引物将扩增微卫星重复序列及其周围的DNA区域。
4.MLVA引物的扩增：将设计好的MLVA引物与预扩增的DNA模板混合，进行PCR扩增。
PCR扩增反应中的引物浓度、缓冲液组成、降低PCR抑制物质（如血红素和其他化合物）对扩增反应的成功至关重要。
5.扩增产物的测定和分析：将PCR扩增产物进行凝胶电泳，可以用琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳或自动测序进行分析。
分析产物的大小差异，可以判断不同菌株的差异。
总结起来，MLVA分型技术是一种基于PCR扩增的分型技术，它通过设计特异的引物，扩增目标DNA片段，并通过凝胶电泳等方法对扩增产物进行分析和解释，从而实现对细菌的分型和鉴定。
这项技术在疫情追踪和溯源中具有重要的应用价值。
基因分型的方法及其原理
基因分型的方法及其原理基因分型是一种对个体的遗传信息进行分析和描述的方法，它能够帮助科学家们了解不同基因型在表现型上的差异，为研究遗传疾病、种群遗传学以及个体化医学等领域提供重要依据。
本文将详细介绍基因分型的方法及其原理，让读者更深入地理解这一重要的遗传学技术。
1. 基因分型的方法：基因分型的方法有多种，其中包括基于PCR的多态性分析、序列特异性引物扩增（PCR-SSP）、序列标记的分析（SNP）、等位基因特异性PCR扩增等。
下面将分别介绍几种主要的方法。
（1）PCR多态性分析这是一种利用多态性位点进行基因分型的方法，通过PCR扩增特定的DNA片段，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等技术来分析不同个体的基因型差异。
这种方法主要适用于一些基因座具有多态性的情况，例如人类HLA系统、STR（Simple Tandem Repeat）位点等。
（2）SNP分型SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是指在基因组中的单核苷酸位点上存在着两个或两个以上的等位基因，由于其高度稳定和广泛分布，成为了基因分型的重要标记。
SNP分型采用基因芯片或测序技术来检测不同个体在SNP位点上的等位基因，从而进行基因型分析。
（3）等位基因特异性PCR扩增这是一种利用等位基因的特异性差异进行基因分型的方法，通过设计特异性引物来扩增含有特定等位基因的DNA片段，然后利用电泳等技术进行分型分析。
这种方法常用于检测特定基因的等位基因，如血型基因、遗传病基因等。
2. 基因分型的原理：基因分型的原理主要基于基因座上的多态性差异或等位基因的特异性差异进行分析。
不同方法的原理略有不同，但都围绕着检测和分析不同个体在特定基因座上的遗传差异展开。
（1） PCR多态性分析PCR多态性分析的原理是利用引物特异性扩增不同等位基因的DNA片段，然后通过电泳等技术进行分型分析。
多态性位点会在电泳图上呈现不同的片段模式，从而实现对不同基因型的鉴定。
SNP分型技术简介3(高遄)
5.1.1限制性片段长度多态性法 PCR- RFLP
原理： 利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种 或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断， 如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会 出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP 位点。
4.2疾病的关联分析
心脏病、癌症、糖尿病、精神病等的遗传变异是 人类遗传学家面临的一个主要挑战。 这类疾病通常隔代遗传，结果使曾经成功运用于 孟德尔疾病的传统的家系连锁分析在此使用受限， 复杂性疾病是遗传和环境综合作用的结果。 目前，发现这些多基因疾病微效基因最有力的方 法是利用与疾病基因关联的DNA 标记，对病例 组和对照组的标记的等位基因频率进行统计学比 较，SNP是这种分析很好的一种标记。
5.2基于PCR 的方法
5.2.1等位基因特异性PCR ( AS-PCR) 序列特异PCR ( PCR-SSP )
单管双向等位基因专一性扩增(SB - ASA)
5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
原理： 根据 SNP位点设计特异引物。 其中一条链(特异链)的3′末端与 SNP位点的碱 基互补(或相同) ，另一条链(普通链)按常规方法 进行设计，因此，AS-PCR技术是一种基于SNP 的PCR标记。 因为特异引物在一种基因型中有扩增产物，在另 一种基因型中没有扩增产物，用凝胶电泳就能够 很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定基因 型的 SNP。
5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
5.2.1等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
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基因突变检测技术
? 测序；
? 探针；
? 质谱；
基因突变检测技术
测序
探针
质谱
原始信号 一级信息 二级信息
…… 最终信息
光
光
光
探针结合
分子量
序列是否改变
推论
分子大小是否改 变
推论
碱基序列是否改变
Pyrosequencing - Chemistry
light time
Signal
PPi ATP
Light
Q24 Instrument Design
X-Y drive positioning Reagent cartridge (Ink jet delivery)
24 well plate mix & thermostat
Lens array
CCD camera detection
焦磷酸测序的原理
准确度决定临床判断的价值
? 12ASP 突变型（ ARMS ）引物 P1 TTGTGGTAGTTGGAGCTG A
? 12ASP 突变型（ ARMS ）引物 P2 TTGTGGTAGTTGGAGCT CA
? 12ASP 突变型（ ARMS ）引物 P3 TTGTGGTAGTTGGAGC AGA
图1 3条ARMS引物的扩增曲线 （模板为 3*108 copies/ul 野生型质粒）
mRNA差异表达的相对定量分析
两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-delta Ct法。
基因修饰的检测
DNA甲基化修饰：
基因甲基化的检测意义
基因甲基化检测的意义
目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是 因为人们发现肿瘤的发生与抑癌基因启动子区的 CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭非常可能有关。 ? 甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测
? 金标准（Golden standard ）在检测中的作用：
? 现有技术所能达到的最先进水平，最接近客观事实，或者 反映的就是客观事实本身；
? 如同病理诊断；
为什么测序是金标准？
? 人类基因组计划（human genome project, HGP ）； ? 1990年正式启动人类基因组测序计划, 2003年完成。
AGGATCT ????????? CT
T C C T AGA
Sequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGAT
45%
48%
47%
45%
45%
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Dispensation Order:
E S G T C T G T C GT A G TC GC T GA T C GT A G T CGA
～2h
～2h
～15min
～10-100min
DNA提取 DNA purification
PCR扩增 PCR amplification
测序样本准备
Pyro测序
Sample preparation Pyrosequencing
结果分析 Genotyping and identification
基因表达水平的检测
个体化分子诊断的检测技术
提纲
? 个体化诊断的内容 ? 个体化诊断的技术简
性别
年龄 老年人 儿童 新生儿
环境因素 饮食 / 吸烟/ 合并用药
药物反应个体差异
病程
并发症
脏器功能 肝, 肾, 心
个体化基因检测方向
? 突变 （mutation ） ? 表达水平（level of expression) ? 甲基化修饰（methylation)
? 检测mRNA 的水平；
基因表达水平的检测技术
? mRNA 的降解； 20℃时，Y=0.62-0.004X（R=-0.981，P<0.001）； 15℃时，Y =0.965-0.001X（R=-0.709，P<0.001）； Y：18sRNA含量 X：离体时间
? 对标本位置的要求；
mRNA 表达水平是相对定量
焦磷酸测序的优点
? 准确度高 ? 灵敏度高 ? 相对定量判读
检测下限影响临床判断
可检测 3%的突变
检测方法敏感度影响临床判断
100
90
例 80
比 占
70
所 60
因
基 50
40
30
20
10
野生型 突变型
灵灵敏敏度度：：33%0%
基因突变检测流程 Pyrosequencing
收取样本：血样或组织
图2 3条ARMS引物的扩增曲线 （模板为 3*108 copies/ul 突变型质粒）
基因突变检测技术对比
性能 检测通量
测序技 术
荧光 PCR
探针
基因芯 片
悬液芯片
ARMS
DHPLC
高
低
高
高
低
高
灵敏、准确度 高
高
一般
高
一般
高
重复性
好
好
一般
好
好
好
可否定量
是
否
是
是
否
否
技术可靠性 金标准
/
/
/
/
/
基因突变检测技术对比
? 肿瘤的分级
? 甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗 效评估的指标。
焦磷酸检测基因甲基化
甲基化程度的量化
无法定量的甲基化检测
? 识别人类基因组的所有大约 3万个DNA ? 测定组成人类基因组 DNA的约30亿对核苷酸的序列
测序应用的新高度
? 对定性检测（Qualitative test ）进行定量分析（ Quantitative Test ）；
突变定量检测的必要性
? 突变负荷（mutational load ）； ? 疾病不同阶段（stage of disease ）； ? 对应的策略不同；
5
10
15
20
25
探针技术的常见应用
ARMs
液相芯片 基因芯片 荧光PCR
引物数量 探针
信号捕捉 判读
2
2
2
SybGreen 引物
CCD
固定于磁珠 的探针
CCD
固定于玻片 探针
扫描仪或肉 眼
光信号的有无
2 荧光探针
CCD
探针技术——Taqman
探针法的案例——ARMS
? 野生型的序列为
TTGTGGTAGTTGGAGCTGG