PCR-RFLP基因分型方法
江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究
ＡＢＳ ＴＲＡＣ Ｔｈ ｉ ｏ ｈ ｔ ｄ ｏａ ａｙ ｅｔｅｈ ｍｏｏ ｙｏ Ｔ： ｅａｍ ｆｔ ｅｓｕ ｙｔ ｎ ｌｚ ｈ ｏ ｌｇ ｆ Ｅ．ｃ ｌ Ｏ１ ｓｒｉｓｆｏ ｓ ｖ ｒｌｒｇｏ ｓｏ ｎ ｓ ｒ ｖｎ ｅ ｏｉ ７ ｔａｎ ｒｍ ｅ ｅａ ｅ ｉｎ ｆ ｉ ｇ ｕｐ ｏ ｉｃ ５ Ｊａ
钱 慧敏 朱 叶飞 ， ， 董 晨 张平平。 朱凤 才 ， ，
摘 要 ： 目的 对 历 年 从 江 苏省 不 同地 区 分 离 的 肠 出血 性 大 肠 埃 希 菌 Ｏ１７ 以 下 简 称 ： ５ ） 行 分 型 分 析 。 方 法 采 ５（ Ｏ１７ 进 用 多聚 酶 链 反 应一 制 性 片 段 长 度 多态 性 分 析 （ Ｃ － Ｆ ） 法 对 １ ８株 ０ ５ 限 Ｐ ＲＲ Ｉ 方 Ｐ ０ １ ７分 子 分 型 ， 比较 不 同地 区 、 同年 份 菌 型 差 异 。 不 结 果 根 据 Ｅ ０ ｃＲＶ 限 制 性 酶 切 图谱 可 将 菌 株 分 成 Ｊ ０一Ｓ Ｏ十 个 不 同 的 型 别 。 主 要 菌 型 Ｊ０ 占 ６ ． ，Ｓ ２型 与 Ｊ Ｏ Ｓ １Ｊ ｌ Ｓ１ ４９ Ｊ０ Ｓ ｌ型 菌 株 酶 切 图谱 相 似 度 很 高 ，Ｓ ３和 Ｊ ０ Ｊ０ Ｓ ４型 菌 株 数 目较 少 （ ２株 ） 但 近 一 半 属 于 人 源 菌 株 。从 时 间方 面 看 ，９ ９年 分 离 的 菌 １ ， １９
肠 出血 性大 肠埃 希 菌 （Ｅ ｔｒｈ ｍｏｒ ａ ｉ Ｅｓ ｎ ｅｏ ｅ ｒｈ ｇｃ — ｃｅ ｉ ａｃｌ ， ＨＥ ）Ｏ１ ７ 上世 纪八 十 年代 在美 ｈ ｒｃ ｏｉ Ｅ ｈ Ｃ ５ 是
耳聋基因检测 - 2
遵循常染色体隐性遗传模式
在不同人群均具有显著的高发病率
临床表现：绝大多数为先天性重度、
极重度耳聋
2
常见的致聋基因及位点
GJB3基因特点
GJB3基因是我国本土克隆的第一个遗传疾病基因
临床症状主要与GJB3突变基因的外显度有关，表现为正 常听力、轻度耳聋、中度耳聋、重度耳聋及极重度耳聋等
荧光探针法 飞行时间质谱法
测序法
耳聋基因检测常用方法比较
方法
主要设备
检测时间 所需步骤
特点
DNA测序法
PCR仪，测序仪 ＞10H
核酸提取、PCR，金标准，操作繁琐，需
电泳、纯化、测 要专门培训，结果判读
序
复杂
限制性内切酶法 PCR仪，电泳仪 约4H ARMS-PCR法
基因芯片法
P扫C描R仪仪，杂交仪，约5H
荧光PCR法
PDS基因突变 检测 试剂盒
SLC26A4：IVS7-2A>G、1174A>T、、 1229C>T、2168A>G ；
检测位点 （10个）
通量低
厦门致善
GJB2:35delG、167delT、176-
191del16、235delC、299-300delAT
； GJB3：538C>T、547G>A；
12SrRNA：1494C>T、1555A>G；
微阵列 芯片法
微阵列 芯片法
优缺点
检测位点少 （9个） 专用仪器 价格高 耗时长
检测位点 （15个） 专用仪器
价格高 耗时长
凯普
GJB2:35delG、176-191del16、235delC、299-
耳聋易感基因检测 试剂盒
临床免疫学MHC与HLA检测及应用
第二十一章MHC与HLA检测及应用本章要点1.MHC的一般特性2.HLA分型3.HLA分型的实际应用组织相容性是指器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度，如相容则不互相排斥，不相容就会出现排斥反应。
诱导同种移植排斥反应的抗原称为组织相容性抗原，也称为移植抗原。
一组对人和各种哺乳动物中诱导排斥反应起决定性作用的抗原称为主要组织相容性抗原（MHA）。
控制主要组织相容性系统（MHS）的基因包括几个不同位点，集中分布于各种动物某对染色体上的特定区域，，是一组紧密连锁的基因群，这组基因群称为主要组织相容性复合体（MHC）。
第一节MHC的一般特性概念：主要组织相容性复合体（MHC）是一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因。
MHC编码的基因产物为主要组织相容性抗原（MHA）。
人类的MHC即HLA基因复合体位于人的第6对染色体的短臂上，是目前已知最复杂的人类基因系统。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类基因。
HLA由400万碱基组成，传统上分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类基因。
Ⅰ类：包括经典的HLA-A、B、C，非经典的HLA-E、F、G、H、X等；Ⅱ类：包括经典的HLA-DP、DQ、DR，非典型的HLA-DN、D0、DM等；Ⅲ类：位于HLA-Ⅰ、Ⅱ类之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。
截止到l999年，已知的HLA等位基因数已超过l000个，且数量仍在继续增加。
HLA基因复合体所表达的基因产物，除直接构成同种异体移植排斥反应的靶抗原外，在免疫应答的过程中发挥着重要调控作用，也反映着自身免疫性疾病的基因易感性。
一、MHC-Ⅰ类分子MHC-Ⅰ类抗原是一组由非共价键连接的异二聚体分子，在人类包括HLA-A、B、C、HLA-E、F、G、H、X 等。
Ⅰ类分子可广泛地表达于各种组织的有核细胞上，以淋巴细胞、白细胞表面的表达密度最高，肝、肾、皮肤、主动脉和肌细胞次之，成熟的红细胞、神经细胞及滋养层细胞不表达。
血清与其他体液中少量存在。
genotyping原理
genotyping原理基因型(genotype)是指个体或生物体其中一种特定基因的种类或基因组合。
通过对一些生物的基因进行分析，可以确定其基因型，进而了解其遗传特征和相关性状。
基因型分析在遗传学研究、医学诊断和生物技术应用中具有重要的意义。
基因型分析的方法有很多种，其中最常见的是基于DNA序列的分子生物学方法。
基因型分析的原理主要包括DNA提取、基因放大、基因分型和数据分析等步骤。
首先，需要对样本中的DNA进行提取。
DNA提取是分子生物学实验中的第一步，常用的提取方法包括酚/氯仿法、离心法和商用DNA提取试剂盒等。
通过这些方法可以将DNA从细胞或组织中提取出来。
接下来，需要将提取得到的DNA进行放大。
常用的放大方法有PCR（聚合酶链式反应）和SNP（单核苷酸多态性）分析等。
PCR是一种体外的DNA复制技术，可以在短时间内扩增特定的DNA片段。
SNP分析则是通过扩增特定的基因片段来检测个体间的单核苷酸变异。
基因分型是基因型分析的核心步骤。
常见的基因分型技术有限制性片段长度多态性（RFLP）、序列特定引物扩增（SSP）和基因芯片等。
RFLP分析是基于特定限制性内切酶酶切位点的DNA片段长度变异来进行基因分型的技术。
SSP则是通过引物的特异性扩增决定基因分型。
基因芯片则是一种高通量的基因分型平台，可以同时检测数千个基因的单核苷酸多态性。
最后，需要对分型结果进行数据分析和解读。
根据不同的分型技术可以得到不同的分型结果，需要将这些结果与已知的基因型进行比对。
数据分析包括基因型预测、相关性状分析和基因关联研究等。
基因型分析在包括人类疾病遗传研究、种质资源鉴定、遗传育种和亲子鉴定等领域具有重要的应用价值。
通过基因型分析，可以确定个体或物种的基因型，进而了解其遗传特征和相关性状，对于人类健康和物种保护具有重要的意义。
总之，基因型分析是通过对生物体DNA序列进行分析，确定其基因型从而了解其遗传特征的一种方法。
它在分子生物学、遗传学和医学研究中具有重要的意义，可以为人类健康、物种保护和种质资源利用等领域提供有力的支持。
HLA分型法[指南]
![HLA分型法[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/f09ac84b3a3567ec102de2bd960590c69ec3d8b6.png)
HLA 分型法HLA分型技术主要组织相容性复合物（MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。
1984年George Snell 首次发现小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 发现了人的MHC即HLA基因。
MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。
HLA基因，位于6号染色体上短臂上，长约4000Kb。
HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。
由于MHC基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单元型（HAPLOTYPE，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合）为特征的遗传。
按中国人常见的A座位基因有13个，B座位基因有30个计算，可组成的单元型约有13×30＝390种之多。
理论上估计，父母各给一串单元型给子女，便会形成4.3万种HLA－AB血型。
事实上，HLA 各基因并非完全随机地槌傻ピ 停 浅氏殖隽 黄胶猓╨inkagedisequilibrium,LD）的特点。
理论推测的HLA 分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。
世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。
总体来讲，中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。
即使在中国，地区间也存在差异。
在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。
在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10单体型频率呈北高南低分布，在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58-DRB1*13单体型频率呈北低南高分布。
PCR-RFLP
步骤
• • • • • ( 1) 选择目标序列 ( 2) 设计特异引物 ( 3) PCR扩增 ( 4) 酶切 ( 5) 琼脂糖电泳分离与鉴定
特点
• (1) 引物与限制性内切酶组合非常多, 增加了揭示多态性的 机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析; • (2) 在真核生物中,CAPS标记呈共显性, 即可区分纯合基因 型和杂合基因型; • (3) 所需DNA的量很少, 且对DNA的浓度要求不严格; • (4) 使用的引物较长, 扩增的结果比较稳定且避免了RFLP 分析中膜转印这一步骤, 又能保持RFLP分析的精确度; • (5) 操作简便、快捷和自动化程度高。
PCR-RFLP
分子标记
• 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。 • 某种意义上分子标记也指DNA分子标记, 就是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。它能 够直接反映基因组DNA间的差异。
原理
• PCR-RFLP是酶切扩增多态性序列标记技术, 又称为 CAPS, 主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分 析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物, 将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。 • 基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异 性的PCR引物( 19~27bp) , 然后用这些引物扩增该位点上 的某一DNA片段,接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物,凝胶电泳分离酶切片SCP的比较
应用
• 植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定和动物的遗传多样 性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定等方面。
小概念
• DNA的多态性(不同个体间基因组的核苷酸序列存在的差 异性)可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多 态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到 长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一 段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否产生同 样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶的识别位 点时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为 多态性位点。
cyp2c19基因型分型
cyp2c19基因型分型【最新版4篇】目录（篇1）1.CYP2C19 基因的功能和作用2.CYP2C19 基因的多态性3.CYP2C19 基因型分型的重要性4.CYP2C19 基因型分型的方法5.CYP2C19 基因型分型的应用正文（篇1）CYP2C19 基因是肝脏细胞内一种重要的药物代谢酶，主要负责许多临床药物的代谢，例如，抗肿瘤药物、抗癫痫药物、抗抑郁药物等。
因此，CYP2C19 基因的功能和作用对人体药物代谢具有极大的影响。
CYP2C19 基因存在着多态性，即在不同个体中，CYP2C19 基因的序列存在差异。
这种多态性导致了 CYP2C19 酶活性的不同，进而影响了药物在体内的代谢速度和浓度。
因此，CYP2C19 基因型的分型对于个体化用药具有重要的指导意义。
CYP2C19 基因型分型的重要性体现在其能够帮助临床医生根据患者的基因型，选择最适合的药物和剂量，以达到最佳治疗效果，同时减少药物不良反应的发生。
目前，CYP2C19 基因型分型的方法主要有两种：一种是基于聚合酶链反应（PCR）的技术，另一种是基于基因芯片的技术。
这两种方法各有优缺点，但都能够准确地进行 CYP2C19 基因型的分型。
CYP2C19 基因型分型的应用广泛，除了在个体化用药中的应用外，还在药物研发、药物基因组学、疾病诊断等领域发挥重要作用。
例如，通过CYP2C19 基因型分型，可以预测患者对某种药物的反应，从而指导药物的研发和改进。
目录（篇2）1.CYP2C19 基因的功能和重要性2.CYP2C19 基因的多态性3.CYP2C19 基因型分型的方法4.CYP2C19 基因型分型的临床应用5.CYP2C19 基因型分型的未来展望正文（篇2）CYP2C19 基因是肝脏细胞内最重要的药物代谢酶之一，它对许多临床常用药物的代谢起到关键作用。
因此，对 CYP2C19 基因型的研究具有重要的临床意义。
CYP2C19 基因具有多态性，目前已知有多种等位基因，其中最常见为CYP2C19*1 和 CYP2C19*2。
(完整word)临床分子生物学检验 总
四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA)为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1。
菌种鉴定：PCR—测序和PCR—DNA探针杂交;缩短检测时间2。
确定病毒感染和病毒载量:明确感染源,判断病情,监测疗效3.病毒分析:基因型变异产生不同临床症状4。
细菌耐药监测和分子流行病学调查 :随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1。
致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3。
肿瘤相关基因单基因病1。
致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。
2。
致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2。
疾病诊断和遗传咨询3。
多基因病的研究4。
器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。
分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。
重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI） 3。
日本国立遗传研究所(DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。
蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等.蛋白质数据库常用的有SWISS—PROT、 PIR、 PDB数据库。
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PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
引物设计 酶切位点 分析
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
自动搜索 引物
手动编辑 引物
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
前引物的位置（必 须超过突变位点）
后引物的位置 （必须在突变位
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
突变位点，找不 到合适的内切酶
tctcaacaaaaTcaaaactgtaag
tctcaacaGaaTcaaaactgtaag
Hinf I 可以使用PCR-RFLP的
方法基因分型
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
基本原则：
人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的 合适的酶切位点
引物设计
引物设计
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
基本原则：
1. 引物要跟模板紧密结合， 2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在， 3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
需要考虑的因素：
引物长度（primer length）、 产物长度（product length）、 序列Tm值(melting temperature)、 ΔG值(internal stability)、 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site）、 引物及产物GC 含量（composition）
PCR-RFLP:
是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技 术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再 选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳， 可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型 的目的。
PCR-RFLP基因分型方法
概念
PCR-RFLP基因分型方法
几种特殊类型的引物设计
引入酶切位点引物设计 Takara定点诱变试剂盒 定诱变引物设计
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
为什么要引入酶切位点？
突变位点没有内切酶 或者合适的内切酶
通过人为的在引物上改变一个碱基从而使 之与突变位点的碱基构成新的酶切位点
PCR-RFLP基因分型方法
引物设计
工欲善其事，必先利其器
Primer Premier 5.0 引物设计
Oligo 6.0 引物评价
PCR-RFLP基因分型方法
引物设计
新建窗口
输入序列
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
突变位点
选取突变位点 前后约500bp 长度的碱基
概念
Step by step
电
选择内切酶
设计引物
确定基因序列
PCR-RFLP基因分型方法
基因型 泳
基因序列查找
PCR-RFLP基因分型方法
PCR-RFLP基因分型方法
基因序列查找
选择 gene
输入基因名 称
PCR-RFLP基因分型方法
基因序列查找
基因的全称
PCR-RFLP基因分型方法
基因的物 种来源
PCR-RFLP 基因分型方法
---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析
PCR-RFLP基因分型方法
概念
聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP):
是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp
太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度
引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要，
引物3’端的碱基一般不用A A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ， 5’端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。
点之后）
PCR产物 的长度
PCR-RFLP基因分型方法
引物的长度
Primer Premier 5.0
引物的综合评分， 分越高引物越好
引物序列
PCR-RFLP基因分型方法
引物的详细信息
Primer Premier 5.0
发夹结构 二聚体 错配
交叉二 聚体
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
引物的GC含量 ：一般为40-60%，以45-55％为宜
两条引物之间的GC含量不宜相差太大
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最
好相差不要大于5 度
引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5
最好不要位于3’末端
否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的 影响了
ΔG值: 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的
ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而 3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引 发反应而可防止错误引发
PCR-RFLP基因分型方法
PCR-RFLP 引物特殊要求
PCR产物的长度：200-1000bp 酶切后产物片断的大小差距：100bp以上
更高级应用：
参数的设置 手动搜索或者修改引物 搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）
PCR-RFLP基因分型方法
引物纯化方式的选择
去盐（ RPC 、Desalted）纯化 它是一种对DNA有特异性的吸附的树脂，能有效地去除 盐分及小片段的DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、 DNA测序等实验。 PAGE纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE 纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化 后的纯度 大于95%，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。 适用于PCR用引物(如定点诱变引物)，DNA测需用引物， 各种探针等。 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。 适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、 长链DNA、PCR克隆，PC定R-RF点LP基因突分型变方法，人工合成基因等。