PCR-RFLP基因分型方法
(优选)基因多态性与疾病发生遗传易感性
单核苷酸多态性
人类基因组中大约估计每个基因有2个常见的错义突变
在公共数据库中至少有500万个SNPs。 仅有少量（可能为50,000–250,000）SNPs在一定程度上（小到中等度）能反映与
疾病发生危险相关的表型。
根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs， cSNPs ） 、 基 因 周 边 SNPs （ Perigenic SNPs ， pSNPs ） 以 及 基 因 间 SNPs （Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。
基因选择
候选基因（Candidate Genes）
1. 候选基因具有对生物学合理性(biological plausibility)和疾病因果关系(disease causality)
作最大化推理(maximizing inferences)的优点。
2. 候选基因可根据某一特定疾病发生过程中基 因功能信息来加以限制。
基因多态性与基因转录调控 Gene Polymorphism and Regulation of Gene Transcription
展望 Future Prospects
第二页，共100页。
DNA Structure
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基因突变
基因突变（mutation)：由于DNA碱基对的置换、插入或缺 失而引起的基因结构的变化，亦称点突变。
法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等。 在器官移植中供体和受体间的配对选择。
研究人类起源、进化和群体遗传学特征。
第十一页，共100页。
单核苷酸多态性
今后SNP的研究主要包括两个方面：
SNP数据库的构建：主要目的是发现特定种类生物基因组 的全部或部分SNP。大规模SNP数据库构建只是基因组序 列分析中心可以胜任的工作,常规实验室是不太可能进行 该工作的。
耳聋基因检测 - 2
遵循常染色体隐性遗传模式
在不同人群均具有显著的高发病率
临床表现：绝大多数为先天性重度、
极重度耳聋
2
常见的致聋基因及位点
GJB3基因特点
GJB3基因是我国本土克隆的第一个遗传疾病基因
临床症状主要与GJB3突变基因的外显度有关，表现为正 常听力、轻度耳聋、中度耳聋、重度耳聋及极重度耳聋等
荧光探针法 飞行时间质谱法
测序法
耳聋基因检测常用方法比较
方法
主要设备
检测时间 所需步骤
特点
DNA测序法
PCR仪，测序仪 ＞10H
核酸提取、PCR，金标准，操作繁琐，需
电泳、纯化、测 要专门培训，结果判读
序
复杂
限制性内切酶法 PCR仪，电泳仪 约4H ARMS-PCR法
基因芯片法
P扫C描R仪仪，杂交仪，约5H
荧光PCR法
PDS基因突变 检测 试剂盒
SLC26A4：IVS7-2A>G、1174A>T、、 1229C>T、2168A>G ；
检测位点 （10个）
通量低
厦门致善
GJB2:35delG、167delT、176-
191del16、235delC、299-300delAT
； GJB3：538C>T、547G>A；
12SrRNA：1494C>T、1555A>G；
微阵列 芯片法
微阵列 芯片法
优缺点
检测位点少 （9个） 专用仪器 价格高 耗时长
检测位点 （15个） 专用仪器
价格高 耗时长
凯普
GJB2:35delG、176-191del16、235delC、299-
耳聋易感基因检测 试剂盒
等位基因分型
等位基因分型等位基因分型是指在同一基因座上的两个等位基因的具体分型结果。
等位基因是指在同一基因座上存在的不同基因序列，基因座是指染色体上的一段特定的DNA序列。
等位基因分型是通过检测某一基因座上的等位基因来确定个体的基因型。
等位基因分型在医学、生物学和遗传学等领域有着广泛的应用。
通过等位基因分型可以确定个体在某一基因座上的遗传变异情况，从而了解与该基因座相关的疾病易感性、药物代谢能力、遗传性疾病的携带状态等信息。
等位基因分型的常用方法包括聚合酶链反应（PCR）、序列特异性引物扩增（SSP）、限制性片段长度多态性（RFLP）等。
这些方法通过特异性引物或酶切位点来扩增或切割等位基因，然后通过电泳或测序等技术手段分析等位基因的分型结果。
等位基因分型在个体识别和亲子鉴定中有着重要的应用。
通过比对个体在多个基因座上的等位基因分型结果，可以确定个体的唯一性和亲子关系。
这对于刑事侦查和人类遗传学研究等方面具有重要意义。
等位基因分型还可以应用于种群遗传学研究。
通过分析不同群体中等位基因的分布情况，可以了解人群遗传结构和基因流动情况，为人类起源和演化提供重要的证据。
等位基因分型在药物研发和个体化用药中也发挥着重要的作用。
通过检测个体在药物代谢相关基因座上的等位基因分型，可以预测个体对某些药物的代谢能力和药效反应，从而指导个体化用药方案的制定。
等位基因分型还可以用于基因突变的筛查和遗传疾病的诊断。
通过检测特定基因座上的等位基因分型，可以发现某些与遗传疾病相关的突变，为遗传疾病的早期诊断和预防提供依据。
等位基因分型作为一种重要的遗传学分析方法，已经在医学、生物学和遗传学等多个领域得到广泛应用。
通过对等位基因的分型结果的分析和解读，可以获取个体的遗传信息，为疾病预防、药物研发和个体化医学提供重要依据。
探讨基因多态性对甲氨蝶呤代谢及临床的影响及意义
目录引言 (1)研究对象与材料 (3)1研究对象 (3)2治疗方案 (3)3不良反应监测 (3)4仪器与材料 (5)4.1主要实验仪器 (5)4.2主要实验试剂 (6)方法 (7)1PCR法检测基因的分型 (7)1.1基因组的提取 (7)1.2引物设计与合成 (7)1.3PCR扩增 (8)2限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析和测序 (9)3高效液相色谱法测定MTX动态血药浓度 (10)4统计学处理 (9)结果 (11)1.MTHFR基因型与等位基因分布情况 (11)2.MTHFR基因型与HD-MTX化疗后动态MTX浓度的关系 (11)3.MTHFR基因多态性与MTX毒副作用之间的关联性 (12)讨论 (15)结论 (19)参考文献 (20)综述 (20)综述参考文献 (20)攻读学位期间的研究成果 (31)附录 (32)致谢 (34)学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 (35)引言引言白血病是临床上常见的一类造血干细胞恶性克隆疾病，因细胞增殖失控、分化障碍和凋亡受阻等因素所致在骨髓和造血器官和组织内大量增殖，浸润其他组织和器官，影响正常造血功能。
其中急性淋巴细胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）儿童和青少年中最常见的恶性肿瘤之一，占儿童白血病发病率的一半以上，且以每年1%的速度在增长[1-3]。
急性淋巴白血病的主要临床症状为发热、出血、关节疼痛或贫血为主[4]。
该病发生迅速，恶性程度较高，但对化学药物敏感，癌细胞易杀灭[5]。
临床治疗上以甲氨蝶呤鞘内或者静脉注射为主要化疗方式。
1岁以内白血病患儿的生存率40~50%，1岁以上患儿5年生存率超过90%。
因此，ALL的及时发现和诊断对疾病的治疗具有重要意义。
随着分子生物学水平的快速发展，人们不断地从分子水平探寻疾病的发病机理，多年的临床研究表明，ALL的易感性与ALL基因多态性密切相关[6-8]。
载脂蛋白E基因型的检测及临床意义
载脂蛋白E基因型的检测及临床意义张艳敏;辛俊;李萱【期刊名称】《心血管康复医学杂志》【年(卷),期】2002(011)002【摘要】目的:探讨载脂蛋白E(ApoE)基因型的检测方法及其临床意义.方法:用人工合成的寡聚核苷酸引物,通过多聚酶链反应(PCR)特异性体外扩增ApoE基因的特异性DNA片段.扩增产物用限制性内切酶Hhal消化,聚丙烯酰胺凝胶电泳后,进行限制性片段长度多态性(RFLP)基因分型.结果:运用PCR-RFLP方法检测了53例健康人和55例冠心病患者的ApoE基因型.两组对象基因型频率E3/2分别为9.4%和3.6%;E3/3为64.2%和60%;E4/3为26.4%和30.9%;E4/4为0和3.6%;等位基因频率E2分别为0.047和0.027;E3为0.820和0.773;E4为0.132和0.200,P 均>0.05,可能与样本小有关.结论:PCR-RFLP法检测ApoEAD基因型简便、准确,有很强的临床应用价值.【总页数】3页(P137-139)【作者】张艳敏;辛俊;李萱【作者单位】新疆自治区人民医院高血压科,乌鲁木齐市,830001;兰州军区乌鲁木齐总院老年病科;新疆医大一附院干部病房【正文语种】中文【中图分类】R446.112【相关文献】1.应用微流控电泳联合检测载脂蛋白C3基因型 [J], 俞娟;卢美红;王惠民;仲人前2.聚合酶链反应/变性高效液相色谱技术检测载脂蛋白E基因型 [J], 黄盛文;向道康;安邦权;李贵芳;罗振元3.载脂蛋白AI与载脂蛋白B100检测在肝炎后肝硬化并发门脉高压患者中的临床意义 [J], 陈树添;林章礼;吴伟聪4.冠心病患者载脂蛋白E基因型及表型的研究与临床意义 [J], 彭健;龚五星;彭澍;王骏;石理;林岫芳5.基因芯片法检测载脂蛋白E(ApoE)基因型试剂性能验证 [J], 金雅琼;张进因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SNP分型技术简介高遄
1.SNP概念
依据排列组合原理一共可以有6种替换情况： A-G、A-T、A-C、C-G、C-T 和G-T 但事实上，转换的发生频率占多数，而且是C-T 转换为主。 其原因是CpG的C是甲基化的，容易自发脱氨基 形成T SNP在单个基因或整个基因组的分布是不均匀的： （1）非转录序列要多于转录序列 （2）在转录区非同义突变的频率，比其他方式突 变的频率低得多。
4.SNP研究意义
SNPs作为第三代遗传标记-路标的作用。 传统研究策略（表征、蛋白、基因） 逆向遗传学（表型、基因、蛋白）
4.1 4.2
基因组制图 疾病的关联分析
4.3 4.4
药物设计和应用 个体识别和亲权鉴定
4.1基因组制图
“遗传图谱”、“物理图谱”、“放射杂交图谱” 将SNP与人类基因组序列、物理和遗传图谱结合 起来以期在序列变异、疾病关联基因、种族遗传 和基因组扫描等方面作出进一步研究，将会对疾 病的深入了解、诊断方法和新型有效的治疗方法 的发展产生深远的影响。 2000年，SNP图谱，2730个SNPs 定位和作 图。 2001年，国际SNP图谱工作组124万个SNP的 图谱。
3.SNP特性ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相 比，SNP具有更高的遗传稳定性。 分布不均匀 由于选择压力的存在，SNP在整个 基因组中的分布不均匀，在3’表达序列标签 (express sequence tags, ESTs)中的分布 比在其他基因组区域中的少，在非编码区的数目 远远大于编码区。 易实现分析的自动化 由于每个SNP位点通常仅 含两个等位基因—双等位基因(biallele)，在检 测时能通过一个简单的“+/-”分析进行基因型 分型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。
SNP技术
二、双脱氧链终止法
DNA核苷酸序列分析
Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反
应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，
通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子，使之发射出四种不同波长荧光，检测器采 集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
面积的支持物上 。
蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
DNA自动测序结果举例
遗传修饰动物模型的建立 及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核 苷酸的变化，可以是转换，也可是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2/3， 这是因为胞嘧啶是人类基因组中最易发生 突变的位点，其中大多数是甲基化，可自 发脱氨基形成T。 位于染色体上某些区域的一组相关联的 SNP等位位点称为单倍型，相邻SNPs的等 位位点倾向于以一个整体遗传给后代。
DNA条形码技术
T
G
ASO探针
聚合酶链式反应（PCR）
1.PCR技术的创建 2.PCR的原理 3.PCR的反应体系和方法 4.PCR技术的近现代运用
基因组DNA
引物
DNA聚合酶
DNA片段体外扩增
PCR技术的创建
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引 物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得 到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了 PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无 脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞 色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdase I ，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物 Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种 内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出 可以用单一的小片段基因来代表物种；他们 将超市用以区分成千上万种不同商品的条形 码概念引入，把这种小片段基因序列称作物 种的DNA条形码（DNA barcodes）并提出为 全球生物编码的计划。
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要 构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入 细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选; 这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培 养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时 间。
PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多 聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起 点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火 和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30 次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物 进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼 能见到扩增特异区段的DNA带。