基因探针-分子杂交技术
核酸分子杂交法
核酸分子杂交法这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。
基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。
探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。
所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。
同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。
利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。
与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。
将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。
目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。
（一）DNA的变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。
加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
（二）DNA复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。
复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。
核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。
核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
高中生物知识理解探针(probe)的定义和应用
定义2：分子生物学和生物化学实验中指示特定物质（如核酸、蛋白质、细胞结构等）的性质或物理状态的一类标记分子。
我的理解是：定义1是狭义的探针，即核酸分子探针（基因探针），定义2应该是广义的探针，包括单克隆抗体探针（单抗）。
下面“基因探针”的具体应用程序：
探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶，一种临床检验试剂中的常用酶）标记成为探针。
核酸分子杂交示意图
疑难问题：今天在讲解试题中发现，让学生应用DNA分子杂交技术的原理检测植株有没有成为转基因植株，绝大多数学生的答案是用“单抗探针”检测，而不是“目的基因探针”，说明学生对探针不够了解，造成张冠李戴。
定义1：在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。
Hale Waihona Puke 过程示意图 下面是“单抗探针”的具体应用程序：
单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位（即抗原决定簇）相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。
此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。
如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子（蛋白质、核酸、酶等）在细胞中的位置和分布。
磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。
核酸分子杂交过程
核酸分子杂交过程
核酸分子杂交是一种利用两个不同的核酸分子来检测特定基因的技术。
它通过将一个核酸分子 (称为探针) 与另一个核酸分子 (称为模板) 进行杂交来寻找特定的序列。
杂交过程通常需要高温条件来分解核酸分子的二聚体，并使探针与模板结合。
如果探针与模板匹配，则可以使用特定的技术来检测杂交产物。
常见的技术包括 Southern blotting 和 PCR (聚合酶链反应)。
在 Southern blotting 技术中，模板核酸分子被限制性酶切割后，将其电泳分离，然后将其转移到一种特定的膜上，接着用探针核酸进行杂交，再用特定的方法来检测杂交产物。
在 PCR 技术中，模板核酸分子被加热以分解二聚体，然后用特定的引物进行扩增。
这种扩增过程重复进行多次，直到产生足够的样本量。
这种方法能够在短时间内增加核酸分子的数量，因此适用于病毒、细菌和其他微生物的检测。
核酸分子杂交是一种非常重要的生物技术，广泛应用于医学诊断、基因研究、食品安全等领域。
分子杂交技术
分子杂交技术引言分子杂交技术是一种重要的实验手段，在生物学和生物化学领域被广泛应用。
它通过将两个不同源的核酸序列（DNA或RNA）进行杂交，从而得到具有特定性质和功能的新分子。
在本文中，我们将介绍分子杂交技术的原理、应用和未来发展方向。
原理分子杂交技术主要基于核酸的互补配对原理。
DNA和RNA 分子中的碱基有互补配对性质，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）互补配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）互补配对。
在杂交过程中，两个互补的核酸序列会通过碱基间的氢键相互结合，形成一个稳定的双链结构。
应用分子克隆分子杂交技术在分子克隆中起到至关重要的作用。
通过将目标基因的DNA序列与载体DNA进行杂交，可以实现基因的定向克隆。
例如，使用限制性内切酶将目标基因和载体DNA切割开后，通过杂交技术将两者粘合在一起，形成重组DNA，然后可以通过转化、转染等手段将重组DNA导入到宿主细胞中，实现基因的表达。
基因探针分子杂交技术也被广泛应用于基因探针的设计和制备。
基因探针是一种用于检测目标基因在细胞或组织中表达情况的分子工具。
通过将特异性的探针与目标基因进行杂交，可以实现对目标基因的检测和定位。
分子杂交技术可以用于制备放射性或非放射性的探针，例如荧光探针或生物素标记的探针，从而实现对目标基因的高灵敏度和高特异性的检测。
基因组分析分子杂交技术还可以用于基因组分析。
例如，通过杂交技术可以将特异性的探针与目标基因组中的特定区域进行杂交，从而实现对基因组的定位和映射。
此外，分子杂交技术还可以用于研究基因组中的DNA重复序列、非编码RNA等。
DNA鉴定分子杂交技术在DNA鉴定领域也有广泛的应用。
例如，通过杂交技术可以将可疑犯罪嫌疑人的DNA样本与现场留下的DNA样本进行比对，以确定是否属于同一人。
此外，分子杂交技术还可以用于亲子鉴定、物种鉴定等。
未来发展方向随着科技的不断发展，分子杂交技术也在不断更新和发展。
未来，我们可以预见以下几个方面的发展：1.高通量分子杂交技术的发展：随着高通量测序技术的发展，分子杂交技术可以与测序技术结合，实现对大规模样本的高效分析，从而推动基因组学、转录组学等领域的研究进展。
分子杂交名词解释生物化学
分子杂交名词解释生物化学
1.分子杂交（molecularhybridization）：指在体外将两个不同种类的核酸（通常是DNA）互相杂交，形成一个新的双链分子，其中每一条链都来自于不同的原始分子。
2. 探针（probe）：一种标记有特定序列的核酸分子，用于检测样品中是否存在相同或相似的序列。
3. 单链构象（single-stranded conformation）：指单链DNA或RNA分子在特定条件下所呈现的空间结构，可用于分析核酸序列的变异或突变。
4. 限制性内切酶（restriction endonuclease）：一种具有切割特定DNA序列能力的酶，常用于制备DNA片段或检测特定序列。
5. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：一种通过模拟生物体内的DNA复制过程，在体外扩增DNA序列的技术。
可用于检测或分析极微量的DNA样品。
6. 荧光素酶（luciferase）：一种常用于检测生物体内基因表达水平的标记酶。
常与荧光素底物配合使用，通过检测底物发光信号来表征目标基因的表达程度。
7. 反向转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）：一种将RNA转录为cDNA，再通过PCR扩增cDNA的技术。
常用于研究基因表达调控机制。
以上是分子杂交在生物化学领域中的相关概念和术语，相信可以帮助读者更好地了解和应用分子杂交技术。
分子杂交技术
分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。
该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。
根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。
探针必须经过标记，以便示踪和检测。
使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。
下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。
同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
分子杂交技术(精)
1、检测受体细胞中的标记基因是否表达，即是否表现出标记基因的性状，从而判断受体细胞中是否已导入含有目的基因的运载体。
如果检测出标记基因表达的性状，说明运载体已导入受体细胞。
2、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。
检测方法是：采用DNA分子杂交技术。
先将转基因生物的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。
3、检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。
采用DNA与RNA分子杂交技术。
从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mR NA。
4、检测目的基因是否翻译成蛋白质。
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原——抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
5、个体生物学水平的鉴定。
如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度。
又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
目的基因的检测与鉴定的补充课本Southern杂交法一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
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Northern杂交 检测对象为RNA RNA。 1、检测对象为RNA。 Southern杂交不同的是 杂交不同的是： 2、与Southern杂交不同的是：1）不需 要限制性核酸酶切； 要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱 变性，而是采用化学试剂变性法。 变性，而是采用化学试剂变性法。 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知 的特异mRNA的表达水平， mRNA的表达水平 的特异mRNA的表达水平，或比较不同组 织或细胞的同一基因的表达情况。 织或细胞的同一基因的表达情况。
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基因探针 ——分子杂交技术 分子杂交技术
基因探针
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。 或
分子杂交技术的分类
根据其检测对象不同， 根据其检测对象不同，可分为
检测对象 Southern杂交 杂交 Northern杂交 杂交 Western杂交 杂交 DNA RNA 蛋白质 探针 核酸 核酸 抗体
基本操作程序
结果检测 杂交 印迹
将样品在凝胶 上分离， 上分离，然后 将样品通过 影印” “影印”的方 式转移到固相 支持物上（ 支持物上（如 滤膜）。 滤膜）。
可以与dCTP 可以与dCTP连接成 dCTP连接成 地高辛地高辛-dCTP
原理： 原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记） 带有荧光素或酶的标记）
杂交 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂 预杂交： 液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。 杂交： 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
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转移的方法
毛细管虹吸法、电转移法、 毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
探针的制备 一、探针的合成 PCR、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等
地高辛： 地高辛：
杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。
检测与分析
1、放射自显影：适用于放 放射自显影： 射性同位素标记的探针 化学发光检测 2、比色或化学发光检测： 比色或化学发光检测： 适于非同位素标记的探针 通过放射自显影或生化检 测，就可判断滤膜上是否 存在与探针同源的DNA DNA分子 存在与探针同源的DNA分子 及其分子量。 及其分子量。
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。 探针进行杂交。
通过放射自显 影或显色反应， 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。 源的分子。
Southern杂交
检测样品DNA的处理 的处理 检测样品 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
Western杂交
1、基本原理和基本过程与Southern 、基本原理和基本过程与 杂交基本相同 杂交基本相同 2、检测对象为蛋白质（或酶） 、检测对象为蛋白质（或酶） 3、SDS-PAGE电泳分离 、 电泳分离 4、用“抗体 抗原”免疫反应或 抗体-抗原 抗原” 、 “DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 ” 上的蛋白质。 上的蛋白质。
0.4M NaOH 凝胶
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转移并固定到滤膜上
通过毛细管虹吸法，将凝胶上的 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 固定在滤膜上。 将DNA固定在滤膜上 固定在滤膜上
探针的制备及杂交
检测与分析
检测样品DNA的处理
提取检测样品的基因组DNA 提取检测样品的基因组 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的 片段
电泳分离及变性处理
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 片段 琼脂糖凝胶电泳分离 变性处理 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱 变性、化学试剂变性 在0.4M NaOH碱性条件下变性 碱性条件下变性