育种学的论文

山东农业大学 育种学课程论文

题目： 分子标记技术在作物育种中的应用

学 院： 农学院 专业班级： 农学二班 学生姓名： 李辰 学 号： 20132766 指导教师： 郭营 分子标记技术在作物育种中的应用 李 辰 （山东农业大学，农学院，20132766）

摘要:介绍了几种分子标记技术的基本原理和特点, 总结了分子标记技术在植物亲缘关系和遗传多态性研究、DNA 指纹库的建立、遗传图谱的构建及分子标记辅助选择育种等方面的应用, 并对分子标记技术在植物遗传育种领域的应用前景进行了展望。 关键词:分子标记技术;遗传育种;应用

Application of molecular marker technology in crop breeding

Lichen (Shandong Agricultural University Agriculture Institution Tai an 271000) Abstract: introduced the principles and characteristics of several kinds of molecular markers technology, summarized the application of molecular marker technique in plant genetic relationship and genetic polymorphism study, DNA fingerprint database establishment, genetic map construction and molecular marker assisted selection breeding, application prospect and bisection labeling technique in the field of plant genetics and breeding were discussed. Key words: molecular marker technology; genetic breeding; application

0前言 DNA 分子标记技术产生于20 世纪70 年代, 是一种理想的遗传标记技术, 与传统的遗传标记相比,具有诸多优点: (1)不受组织类别、发育阶段等限制; (2)不受环境影响; (3)标记数量多; (4)多态性高;(5)许多标记表现为共显性; (6)简单、快速、易于自动化。目前分子标记主要用于分类学及遗传多样性分析、遗传图谱的构建、目标基因的标记与定位、品种纯度及亲缘关系的鉴定、杂种优势及产量的预测和分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)育种等方面。

1分子标记技术的原理和特点 1.1 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1980 年Bostein 等[ 4] 首先提出了利用RFLP 标记构建遗传连锁图, 而美国冷泉港实室正是利用此技术成功确定了腺病毒血清型突变体的遗传连锁图。RFLP 基本原理是利用特定的限制性内切酶(restrictionenzyme , RE)识别并切割不同生物个体的基因组DNA , 得到大小不等的DNA 片段, 所产生的DNA 片段数目和各片段的长度反映了DNA 分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段, 就形成不同的带, 再与克隆DNA 探针进行Southern 杂交和放射显影, 即可获得反映特异性的RFLP 图谱。RFLP 所表现的是基因组DNA 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上的差异, 主要是由于不同个体基因组DNA序列上的变化, 如碱基替换或缺失造成限制性内切酶酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段的插入、缺失或重复等。但RFLP 技术存在的缺陷, 如在克隆可表现基因组DNA 多态性的探针时较为困难, 阻碍着其更广泛的应用。 1.2染色体原位杂交(Chromosome in situ hybridization) 是一种基于Southern 杂交的分子标记技术。它利用特异性核酸片段作探针, 直接同染色体DNA 片段杂交, 在染色体上显示特异DNA。可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射自显影显示杂交信号, 也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段, 杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。原位杂交的优点是准确、直观, 但技术非常复杂。 1.3 PCR(Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶链式反应。此项技术是模仿DNA 在生物体内的自然复制过程, 来扩增DNA 片段。PCR 的模板是DNA, 依据被扩增区域两侧边界DNA 序列人工合成一对引物(通常为20 个碱基的单链脱氧核苷酸小片段), 每种引物分别与对应的一条DNA 链互补, 在DNA 聚合酶的作用下扩增DNA 片段。PCR 反应一般经三步完成一个循环:1.高温变性, 使DNA 双链解开, 2.低温退火, 让引物与单链模板互补结合, 3.中温延伸, 以互补的引物为复制起点, dNPTS 为原料, 进行复制。这样一次循环, DNA 就扩增一倍。经25 -30 次循环后, DNA 的量就达到足以检测的水平(ng 级)。PCR的优点是不需要同位素, 安全性好, 便宜, 快速易行, 易于自动化。目前大多数分子标记技术都是建立在PCR 技术的基础之上的。 1.4 随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphism DNA,RAPD) 该技术是由Williams 等[ 6] 以PCR 为基础发展起来的一种新型分子遗传标记技术。它是利用随机排列的寡聚脱氧核酸单链引物(一般为8 ～ 10bp), 通过PCR 非定点地扩增染色体组中的DNA 所获得的长度不同的多态性DNA 片段。RAPD 所使用的引物各不相同, 但对任一特定引物它在基因组DNA 序列上具有其特定的结合位点, 一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变, 就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化, 从而引起扩增产物数量和长度发生改变, 表现出多态性。与RAPD 标记类似的还有任意引物PCR(Arbitrarily Primed PCR,AP-PCR)标记和DNA 扩增指纹(DNA Amplification Finger-printing ,DAF)。 1.5 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP) 该标记技术是由Zebeau 和Vos 等[ 7] 发展的一种新的DNA 标记技术。AFLP 实际上是RFLP 与PCR 相结合的产物, 其基本原理是将基因组DNA 进行限制性内切酶酶切, 然后选择特定的片段进行PCR 扩增, 通常使用双链人工“接头”与“接头”相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP 标记所用的专用引物由三部分组成:与人工接头互补的核心碱基序列;限制性内切酶识别序列;引物3′端的选择碱基序列(1 ～10bp)。因此只有那些两端序列能与碱基配对的限制性酶切片段被扩增, 扩增片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测[ 8] 。该技术的优点是在不事先知道DNA 序列信息的前提下, 可以对酶切片段进行经典PCR 扩增。选择碱基包括1～ 10 个数量不等的随机核苷酸序列可以调节AFLP 产物的条带特异性和数量, 提供较多的基因组多态性信息, 同时也克服了RAPD 重复性差的问题。在实验过程中一般采用两个限制性内切酶(一个酶为多切点, 另一个酶的切点较少),因此AFLP 分析中产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。 1.6 简单序列重复(Simple Sequence Repeat ,SSR) 在真核生物基因组中均存在着由1 ～ 5 个碱基对组成的简单重复序列, 又称之为微卫星(microsatellite), 如(GA)n 、(GCC)n 等。同一类微卫星DNA 可分布于整个基因组不同位置上, 其高度多态性主要来源于重复次数的不同或重复程度的不完全性。SSR 是指在生物基因组中存在一个或几个碱基可变次数的串联重复序列(Short tandem repeat, STR)。对SSR 的研究始于动物基因组, 最早发现由二核苷酸CA/GT 重复多次的一段DNA序列, 现已证实存在于真核生物和绝大部分原核生物中。由于每个简单重复序列两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列, 因此, 可以根据两侧序列设计特异引物, 通过扩增产物来显示不同基因型个体在每个SSR 位点上的多态性。作为以PCR 为基础的分子标记, SSR 具有以下主要特点: (1)数量极为丰富, 且分布于整个基因组; (2)多态性高, 等位位点多; (3)以孟德尔方式呈共显性遗传;(4)操作简单, 可直接用PCR 进行分析, 且对DNA质量的要求较低。 SSR 多态性的信息量非常丰富, 具有所有RFLP的遗传学特点, 且比RAPD 的重复性和可信度高。SSR 可产生大量可描述的差异DNA 位点, 有助于从DNA 分子水平上认识品种及个体间的遗传差异。近年来, SSR 具有的优点使其在遗传育种研究中得到广泛应用, 现已被用于基因定位、分子标记连锁图的构建、遗传关系分析、种质资源鉴定及分子标记辅助育种等方面。

2 DNA 分子标记在作物育种上的应用 2.1杂种优势的预测 现代杂交理论认为，杂种优势的大小在一定程度上取决于亲本间遗传距离的大小。李俊雅等模拟群体中基因位点数对估测Nei 氏遗传距离的影响，指出在系统随机整群抽样，样本含量50，期望值在0.1～0.5，应用3 个位点，等位基因有效数为1.75，可使估测的精确性和准确性均有所增加，无疑用微卫星位点估计品种间或品种内遗传距离和结构、判断亲缘关系预测杂交优势是有效的。刘新芝等利用RAPD 标记首次对我国玉米自交系进行了杂种优势群划分。 2.2 亲缘关系和遗传多样性的研究 基因型不同的品种或不同亲缘关系的物种, 基因组内核苷酸序列存在差异, 利用分子标记可以检测出不同品种间的多态性, 这些多态性反映了被检测材料的遗传多样性。江树业等[ 15] 以光敏核不育水稻农垦58S 及其原始株农垦58 核DNA 为模板, 进行RAPD 和ISSR 多态性分析。结果表明, 在可扩增的78 个ISSR 引物中7 个ISSR 引物的扩增产物表现出DNA 多态性。研究表明植物样品经过AFLP 扩增可以获得多达150 个位点特异性片段, 能够充分反映遗传多态性变化。近年来, 已有大量的研究报道应用分子标记技术检测植物(如水稻、玉米、小麦、大豆、蔬菜等)的多态性[ 16～ 18] 。利用分子标记通过相关性、聚类等数量遗传学分析手段, 还可以对不同亲缘种间的分类、遗传距离、系统发育、亲缘关系等进行研究, 从而确定亲本之间的遗传距离, 并进而划分杂交优势群, 提高杂种优势潜力。 2.3 DNA 指纹库的建立 同一物种的各个品种间存在着大量的多态性标记, 如果某一品种具有区别于其他品种的独特标记即一些特异性DNA 片段的组合就称为该品种的“指纹” 。各品种的独特的指纹片段构成物种的DNA 指纹库, 它具有类似于人的指纹那样的高度个体特异性和稳定性。例如魏臻武 利用RAPD 标记技术构建了55 个苜蓿品种(系)的DNA 指纹图谱, 用于苜蓿品种鉴定。DNA 指纹在植物育种中具有广泛应用, 例如:(1)每个品种DNA 指纹差异可直接提供与目标性状有关的DNA 水平的信息, 避免了环境的干扰, 可以大大提高杂交育种中对亲本及后代理想单株的选择效率 ;(2)通过检测品种是否具有该品种特有的指纹片段, 可以有效地鉴定品种纯度与真伪、新品种登记和品种知识产权保护等 。 2.4 遗传图谱的建立和基因定位 遗传图谱是植物资源、遗传育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。与经典遗传作图相比,分子标记技术是构建植物遗传图谱的一种较为简便快捷的理想方法。Faye 仅用3 个月时间就构建了玉米的AFLP 遗传图谱,共得到1032 个标记。在连锁图的绘制上, 各种分子标记技术结合使用可以建立起完整的高密度的分子图谱。例如MBA 等在木薯已有的