外周血淋巴细胞RNA提取(总结)
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一．外周血淋巴细胞RNA提取
1.外周血淋巴细胞分离提取：
10ml 人外周血血样（EDTA-2K抗凝管采集）
稀释血样：D’Hanks 以1:1稀释
加入淋巴细胞分离液（稀释血样：淋巴细胞分离液=2:1）
室温，2000rpm/min 离心20min
吸取单个核细胞层
D’Hanks洗涤细胞
1500 rpm/min 离心10min
D’Hanks洗涤细胞
1000 rpm/min 离心10min
收集淋巴细胞沉淀（细胞计数：约1×107个细胞）
2.外周血淋巴细胞RNA提取：
1×107个淋巴细胞中加入1ml TriZol，4℃静置5min，裂解
加入200ul氯仿，上下颠倒至溶液出现浆白色，无分相现象
置于冰上5min；4℃，12000rpm/min，离心15 min
将上层水相移入另一离心管，加等体积异丙醇，冰上孵育10min 4℃，12000rpm/min，离心10 min
弃上清，在沉淀（含RNA）中加1ml 75%乙醇洗涤
4℃，12000 rpm/min，离心5 min，得到RNA沉淀；
空气干燥后，用适量TE或无RNase水溶解备用
RNA浓度：1400μg/μl，OD260/OD280=2.00
淋巴细胞分离液：
上海华精生物高科技有限公司
标准号：Q/GHSB 85-2001 批号：040524
二．1st-Strand cDNA合成反应：
2. 65℃保温5min后，冰上迅速冷却。
4. 缓慢混匀。
5. 按下列条件进行反转录反应：42℃ 30-60min，95℃ 5min，冰上冷却。
以PET28a为载体表达产物N端带有可以被thrombin酶切的组氨酸标签，
上游primer：5’-GGAATTC CATATGACCTGCTGCAGTCTACAC -3’ (Nde I酶切位点以及保护碱基)
下游primer：5’-CCG CTCGAG TTA AAATTTTAATAGCTAGTCTTCG-3’(Xho I酶切位点以及终止密码子、保护碱基)