人外周血淋巴细胞微核测定

7、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择 、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检， 细胞分散均匀，染色良好的区域， 细胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察 转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。 转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。转化淋 比较， 巴细胞与未转化淋巴细胞比较 前者细胞较大， 巴细胞与未转化淋巴细胞比较，前者细胞较大，胞 核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核 核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、 仁多，胞浆丰富，常见空泡和伪足。 仁多，胞浆丰富，常见空泡和伪足。 微核的识别： 微核的识别：微核是存在于已转化的胞浆完整的淋 巴细胞中的小核，其直径为主核的1／3以下，形态 巴细胞中的小核，其直径为主核的 ／ 以下， 以下 为圆形或椭圆形，嗜色性和主核一致或略浅， 为圆形或椭圆形，嗜色性和主核一致或略浅，必须 与主核完全脱离。一个细胞中， 与主核完全脱离。一个细胞中，不论出现一个微核 或多个微核，均按一个有微核的细胞计数， 或多个微核，均按一个有微核的细胞计数，微核细 胞率以千分率表示， 个已转化的淋巴细胞中 胞率以千分率表示，即1000个已转化的淋巴细胞中 个已转化的淋巴细胞 有微核的细胞数。 有微核的细胞数。
三、实验用品 （1）器材：离心管、注射器、培养瓶（10ml）、 ）器材：离心管、注射器、培养瓶（ ）、 吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、 吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水 浴箱。 浴箱。 染液、 磷酸缓冲液、 （2）试剂：Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、 ）试剂： 染液 磷酸缓冲液 RPMI1640培养液、PHA溶液、0.075mol／L 培养液、 溶液、 培养液 溶液 ／ KCl溶液、甲醇 冰醋酸固定液 溶液、 溶液 甲醇:冰醋酸固定液 （3）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。 ）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。
作业: 完成实验报告（实验目的、实验原理、实验用 品、实验步骤、结果统计与分析）。
实验结果统计
学号
观察细胞数
观察具有微核的外周血淋巴细 胞数
总计
微核千分率
人外周血淋巴细胞微核测定
一、目的要求 1、掌握人外周血淋巴细胞微核标本制备方法。 2、熟悉人外周血淋巴细胞微核的 实验原理 人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的G 人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的 0期， 在含有PHA的培养基中进行体外培养后，原来处于 的培养基中进行体外培养后， 在含有 的培养基中进行体外培养后 G0期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能 期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞， 在细胞分裂过程中， 力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用 影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤， 影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色 体断裂， 体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动 进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。 进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验 是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法， 是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在 人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物， 人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物， 检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。 检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时 也成为检测致突变、致癌、 也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效 应的一种重要手段。 应的一种重要手段。
四、实验步骤
1、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分 、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种， 别加入受试物（ 终浓度 终浓度100ug/ml）培养 小时，收获前 小时， 别加入受试物（CP终浓度 ）培养72小时 不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。 不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。 2、低渗：加入0.075mol／L KCl溶液 、低渗：加入 溶液4m1。混匀后放入 ／ 溶液 。 37℃恒温水浴箱中低渗处理 分钟。低渗时间可根据预实 分钟。 ℃恒温水浴箱中低渗处理10分钟 验中细胞完整程度进行调整。 验中细胞完整程度进行调整。 3、预固定：低渗结束后加入甲醇 冰乙酸（3:1）固定液 ， 、预固定：低渗结束后加入甲醇·冰乙酸 冰乙酸（ ）固定液lml， 混匀后离心（1000rpm）5分钟。 混匀后离心（ ） 分钟。 分钟 4、固定：弃上清液，加入5ml固定液，混匀后离心 、固定：弃上清液，加入 固定液， 固定液 分钟。 （1000rpm）5分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再 ） 分钟 弃上清液，留沉淀物。 固定一次。 固定一次。 5、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。 、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。 6、染色：用Giemsa染液染色 10分钟。自来水细水冲洗后， 、染色： 分钟。 染液染色 分钟 自来水细水冲洗后， 晾干。 晾干。