细胞爬片制作(Hela细胞为例)
细胞爬片染色步骤
免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。
3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。
阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。
8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
细胞培养（hela, 293,239T等细胞的培养）Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤1.爬片的准备1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片刻，可依据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成适合的大小，以备置于6 孔板、 12 孔板或 24 孔板； 2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡留宿，次日先用自来水冲刷 20 遍，而后置于无水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲刷 3 遍，放在饭盒或许玻璃培育皿中烘干后高压消毒。
高压消毒后拿出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。
3)可将爬片用多聚赖氨酸办理，以使细胞与爬片联合更坚固。
1mg/ml 的多聚赖氨酸用0.22um 的滤器过滤除菌后分装于经过无菌办理的1ml 细胞冻存管内保留在 4℃里，三个月内仍旧能够使用。
用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml 的多聚赖氨酸溶液内浸泡 5min，无菌晾干即可（放入培育板孔内注意爬片的正反面）。
或将爬片铺于培育皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温 10 分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。
储藏、稀释和汲取多聚赖氨酸要使用塑料制品。
2.细胞爬片1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完整培育基中，充足吹打，使之成单细胞悬液，计数。
2)依据自己的需要选择适合的细胞密度种入培育板内。
滴加细胞悬液时，依据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的地点滴少许培育基，而后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培育皿靠培育基的张力粘合到一同，防备加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。
若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。
3.细胞的固定及免疫荧光1)在培育板中培育好细胞后，吸除培育基，一般先使用 PBS轻洗细胞 2× 3 min，而后再做固定（凋亡的 TUNEL染色等能够不冲洗）。
1 / 32)固定：加入 4%多聚甲醛 (PBS配制 )固定 20 分钟。
假如临时不可以立刻做组化检测，使用含 0.4%多聚甲醛的 PBSPH7.4浸泡细胞（注意在免疫组化检测达成前不要让细胞变干，不然细胞缩短形态不好）。
直接制备细胞涂片的方法
直接制备细胞涂片的方法
细胞涂片是一种基础的细胞学研究技术，也是细胞学和组织学实验中
经常使用的方法。
制备细胞涂片的过程需要在保持细胞完整性的同时，使细胞均匀分布于载玻片上。
下面将介绍一种直接制备细胞涂片的方法：
实验材料：
1. 空玻片
2. 细胞悬液
3. 细胞培养液
4. 神经刀
5. 羟甲基纤维素
操作步骤：
1. 将干净的玻璃片放入试管中加入适量的羟甲基纤维素溶液，充分浸
润。
取出空玻片挂在玻片架上用酒精棉擦拭干净。
2. 用细胞培养液将细胞悬液充分悬浮。
3. 用吸头吸取适量的细胞悬液，均匀滴在已经浸润了羟甲基纤维素的玻片上，滴头离空玻片的顶部约1 cm。
4. 用神经刀在空玻片上做V字形的切口，先从一端到另一端，再从上到下。
V字口的尖端朝离滴液边缘最远的一侧。
注意力度要轻，以避免切破空玻片。
5. 将玻片静置约2分钟，让滴液充分渗透。
过程中要注意保持玻片平放。
实验室环境湿度低的时候可以用湿棉花覆盖。
6. 架在荧光显微镜或者普通显微镜上检查涂片是否均匀。
可以采用另一个空玻片轻轻压在细胞涂片上，使细胞充分接触玻片表面，然后将其取下。
7. 将制备好的涂片置于37°C恒温培养箱内，待其干燥。
干燥后可以染色、抗体标记、显微镜观察等。
总结：
制备细胞涂片的方法是细胞学和组织学实验中必不可少的技术之一。
其中直接制备细胞涂片方法简单、快捷，通常用于常规检查和初步鉴定。
在实际应用中，可以根据需要灵活选择不同的制备方法。
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片：1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。
将培养基预热至适宜的温度。
2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。
3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。
4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。
5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。
根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。
固定：1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。
2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。
3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。
免疫荧光：1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。
2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。
3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。
4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。
5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。
6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。
7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。
细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。
这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。
整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
《Hela细胞传代培养》课件
细胞数过低
细胞数量太少，可能是由于接 种量太少、营养不足或培养时 间太长等原因导致。可以通过 增加细胞数或更改营养物质来 解决此问题。
将细胞冻存存储，需要在恰当的时机进行复苏。
2 细胞的染色体分析技术
可以使用荧光原位杂交法、karyotyping和CGH等技术来分析细胞的染色体。
3 病毒感染实验技巧
可用于研究病毒的生物学特性、宿主针对病毒的反应等多个方面。
Hela细胞传代培养的应用领域
癌症研究
• 研究癌细胞 • 开发新的抗癌药物 • 探究癌症的发病机制
基因工程
• 研究基因功能 • 进行基因编辑实验 • 疾病的基因诊断和治疗
药物筛选
• 筛选对癌症具有杀伤 力的药物
• 筛选开发新药物的唯 一模型
• 提高药物筛选效率
总结和展望
总结
Hela细胞作为医学研究中最常见的细胞类型 之一，被广泛应用于生命科学领域。
展望
随着技术水平的不断提高，Hela细胞在人类 疾病研究、药物开发等领域的应用前景将广 阔且具有无限潜力。
《Hela细胞传代培养》 PPT课件
欢迎来听我的《Hela细胞传代培养》课程。本课程将会涵盖Hela细胞的来源 和特点，以及传代培养过程、应用领域、实验技巧和常见问题等。
Hela细胞的来源和特点
来源
Hela细胞是从美国Henrietta Lacks的宫颈癌细胞中分离出来的。这些细胞于1951年首次分 离出来，并被广泛应用于医学领域。
特点
Hela细胞具有很高的无限分裂能力和稳定的染色体组成，是许多细胞与分子生物学研究的 理想材料。
应用
这些细胞在癌症、病毒学、基因工程、药物筛选等领域都得到了广泛的应用。
Hela细胞
Hela细胞
Hela细胞，是来源于1951年一个非洲裔美国女性Henrietta Lacks的宫颈癌细胞。
这一种细胞被称为永生细胞，因为它具有不寻常的生长特性，能够无限制地分裂增殖。
Hela细胞的独特之处在于其快速繁殖速度和对各种研究的广泛应用。
Hela细胞的发现是细胞学领域的一个重大突破。
通过研究Hela细胞，科学家能够更深入地了解细胞的生长和分裂机制。
这些细胞已经被广泛用于医学研究、疾病治疗和药物开发等领域。
Hela细胞的广泛应用也引发了一些伦理和法律问题。
Henrietta Lacks的细胞在没有她本人或家人的知情同意的情况下被使用，引发了对个人隐私权和细胞样本所有权的讨论。
这些问题促使人们重新审视细胞样本的使用和保护，以确保公平和透明。
虽然Hela细胞在科学研究中发挥了重要作用，但人们也要意识到细胞样本的来源以及使用的伦理和法律问题。
通过更加谨慎和透明地处理细胞样本，可以确保科学研究的合理性和公正性。
总的来说，Hela细胞的发现对细胞生物学和医学研究产生了深远影响，但我们也必须关注其中涉及的伦理和法律问题，以建立更加公正和透明的科研体系。
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细胞爬片SOP（以Hela为例）
1、在六孔板中加入细胞爬片，然后铺上5X105个细胞培养24h.
2、待细胞贴壁后，配制转染混合液，将2ugDNA加至250ul无血清DMEM中混匀，室温静置5min；加5ul soinfection 转染试剂加至250ul 无血清DMEM中混匀，室温静置5min；然后将两者混匀室温孵育30min.
3、将转染混合液缓慢而分滴加至6孔板中培养48-72h
4去细胞上清，用PBS清洗2次，新配80%冷丙酮固定液加入细胞中，室温作用10min，
5、PBS洗2遍，每次洗5min。
加入2%BSA（每孔500ul）封闭30min，再次PBS清洗两次
6、加入0.1% Triton-X100（每孔500ul）孵育10min,PBS清洗两次
7、加入稀释好的一抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。
8、PBS清洗3次，加入稀释好的二抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。
9、用PBS清洗三次后进行细胞核染色。
加1:200稀释好DAPI染色，室温作用30min。
10、用PBS清洗2次后，将爬片取出，用吸水纸吸干表面水并去除周边细胞，用记号笔圈出孵育抗体的细胞。
11、滴一滴封片剂在载玻片上，然后将细胞爬片倒放在载玻片上，用白色指甲油封片。