第三章-荧光分析

2.激发波长
绘制荧光激发光谱，选择能产生最强荧光的 激发波长（ex），即最大激发波长，作为分析的 激发波长。
3. 发射波长
绘制荧光发射光谱，选择能产生最强荧光的 发射波长（em），即最大发射波长，作为荧光测 定波长。
4.浓度线性范围 分子荧光分析仅适用于稀溶液，溶液 的浓度应低于10-6 g· -1（A＜0.05） L 荧光物质浓度较低时，荧光强度If与物 质浓度c成线性关系。 在一定条件下，绘制If ～c标准曲线确 定浓度线性范围，以减小测量误差。
利用化学反应使一些不能产生荧光的化合 物转变成荧光物质； 或将芳香族化合物与适当荧光试剂反应， 生成强荧光物质，可提高方法的灵敏度，
方法：增大分子共轭体系或增加刚性
常用的化学反应方法
1）氧化还原反应
血浆中苯妥英：二氯乙烷萃取，再转入NaOH 溶液中，用KMnO4氧化成二苯酮，二苯酮在H2SO4 作用下产生强荧光（ex=360nm，em=490nm）。
本章小结
一、分子荧光基本原理
物质受到光照射时，吸收某种波长的 光之后还会发射出比原来所吸收光的波长 更长的光，这种现象称为光致发光，最常 见的光致发光现象是荧光和磷光。
激发
hv
激发态
去激发
hv f 基态
内转换 S2
振动弛豫 体系间跨越 T2
T1 发 射 荧 光
S1
能 量
外转换
发 射 磷 光
S0
5. 读出装置
①记录仪 ②阴极示波器 ③显示器
光 源
单色器
样品池 If 单色器
It
记录仪
检测器
2．荧光光度计与紫外－可见分光光度计区别：
（1）两个单色器，分别在样品池前后：激发单色 器（第一单色器）、发射单色器（第二单色器） （2）样品池：紫外可见光被吸收（池）、荧光发 射（池）
（3）激发光源（入射光）与荧光检测器相互垂直 放置。可避免入射光或透过光对微弱荧光的干扰。
通过有机化合物与金属离子形成配合物
HO
OH
HO
O
OH
C
O C O
C
O C O
酚酞
荧光素
f=0
f = 0.92
-OH N
Mg
-O N Mg1/2
8-羟基喹啉 弱荧光
8-羟基喹啉镁
强荧光
分子的刚性共平面使荧光效率增大：
①分子共平面越大，共轭程度越高。
②分子共平面越大，刚性越强，振动越 小，与其他分子发生碰撞造成无辐射 跃迁几率减小。
二、激发光谱、荧光发射光谱
激发光谱：固定荧光发射波长(em)，改变 激发波长（ex）， 以激发波长为横坐标、 荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。 荧光发射光谱：固定激发波长(ex)，改变 发射波长（em），以发射波长为横坐标， 荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。
特点：
①发射光谱形状与激发波长无关
N
氨苄青霉素
2,5-二酮哌嗪
3）与荧光试剂反应
磺胺类药物与荧光试剂邻苯二甲醛缩合反应， 生成荧光化合物。
H2N SO2NH2 + CHO CHO
O C N C H2 SO2NH2
含氨基的药物与荧光试剂丹酰氯（DANS-Cl） 反应，生成荧光化合物。
H3C N CH3 H3C N CH3
+ RNH2 SO2Cl SO2NHR
因此，在较低温度下测定荧光，有利 于提高分析的灵敏度。
（2）溶剂效应
增大溶剂极性，f 增大，荧光波长向长波长
方向移动。
含重原子的溶剂（如CBr4和C2H5I），引起
体系间跨越，物质f 减弱。
与荧光分子形成氢键的溶剂，使分子f 减弱
极性增大 溶剂 If 苯 1 乙醇 30 水 1000
喹啉在不同溶剂中的相对荧光强度
OH HO N N
2,2’-二羟基偶氮苯
H C O C OH
二苯乙醇酮
OH
8-羟基喹啉
O
OH O
黄酮醇
二、有机物分析
1. 直接法
芳香族化合物大多能发荧光，可直接测定。
例：在微碱性条件下，可直接测定： 对氨基萘碘酸:c > 0.001μg·mL-1 蒽: 0~5μg·mL-1
2.间接法
（4）取代基效应： •芳环上有给电子基，使荧光增强 •吸电子基，使荧光强度减弱 •重原子（Br和I）引起体系间跨越， 使荧光强度减弱。
3.影响分子荧光的外部因素
（1）温度： 温度越高，荧光效率越低，温度越低， 荧光效率越高。 （2）溶剂效应： •溶剂极性越大，分子荧光效率越高； •含重原子的溶剂导致体系间跨越，分子荧 光效率下降； •与荧光分子形成氢键的溶剂，使分子荧光 效率下降。
+ HCl
DNAS-Cl
DNAS-NHR
三、分析条件的选择
1.仪器校正
（1）波长
荧光光度计长期使用，或更换检测器等重 要部件，可用汞灯标准谱线对单色器波长进行 校正。
（2）灵敏度
在选定波长及狭缝宽度的条件下，用某 种稳定的荧光物质配成标准溶液进行校正。 若被测物质的荧光很稳定，也可用作标准溶 液对仪器的灵敏度进行校正。
（4）取代基效应（芳香环）
使f • 给电子基 -NH2、-OH、-OR • 吸电子基 -COOH、-NO2、 -NO 使f • 某些重原子（卤族Br或I），引起 体系间跨越 使 f
3.化学环境与荧光
（1）温度
温度升高， f ↓；温度降低， f ↑
原因：温度升高，分子间碰撞频 率增加，外转移几率增加
常见荧光熄灭剂：
卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物等。 发生碰撞而使之失去能量 生成不发光的化合物
溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系 间跨越，转变成三重态
荧光自灭：荧光物质浓度增大时，荧光强度减弱
第三节
荧光光度计及荧光测量
分类：
荧光光度计：色散元件为干涉滤光片
荧光分光光度计：色散元件为光栅
i
f
由公式：k f ，
k f ki
i f
kf
k ，分子的荧光效率
。
k f 主要取决于分子结构；
k 主要取决于化学环境。
i
分子产生荧光的条件：
1.对紫外－可见光有强吸收。(分子结构) 2.分子去激发时，无辐射跃迁几率小，
辐射跃迁几率大。（化学环境）
2.分子结构与荧光
与有机试剂形成配合物后测定（约60种元素）
测定离子 Al3+ FB4O72Li+ Sn4+ 激发波长 发射波长 ex/nm em/nm 470 500 2,2’-二羟基偶氮苯 470 500 2,2’-二羟基偶氮苯 二苯乙醇酮 8-羟基喹啉 黄酮醇 370 370 400 500 580 700 荧光试剂 检测限 μg·mL-1 0.007 0.001 0.04 2.0 0.2
1
2
2
3
去激发的方式：
产生荧光
产生磷光
外传移，放出热量
二、影响分子荧光的因素 1. 荧光效率f（荧光量子产率）
发射荧光的分子数 f 被激发的分子总数
或
发射光量子数 f 吸收光量子数
f还可表示如下：
f
k f ki
kf
k f 为荧光发射过程的速率常数
k 为各种无辐射跃迁过程的速率常数之和
色散元件
滤光片 — 荧光光度计
光栅 — 荧光分光光度计
荧光分光光度计
①激发单色器:置于样品池前，得到单色性好的
激发光（ex，I0）
②发射单色器:置于样品池后，从荧光光谱中分
离出某一波长的荧光（em，If）
3. 样品池
以石英为材料，四面均为透光面。
4. 检测器
①光电管——荧光光度计 ②光电倍增管——荧光分光光度计 ③二极管阵列及电荷转移检测器——高档荧光分 光光度计
If
a
b
300
400
500
/nm
硫酸喹啉的激发光谱和荧光发射光谱
S1 (V 0) S0 (V 0，2) 1， hc
f
②发射光谱与激发光谱呈镜像对称关系
a If
荧光激发光谱
b c
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
500
/nm
蒽的激发光谱和荧光发射光谱
三、荧光定量分析基本原理
（3）pH
对酸碱化合物，溶液pH影响较大：
NH3+ OHH+
NH2 OHH+
NH-
pH<2 无荧光
pH 7~12 蓝色荧光
pH>13 无荧光
α-萘酚：
OHH+ OH O-
无荧光
有荧光
（4）荧光熄灭剂
荧光熄灭：荧光物质分子与溶剂分子或其 它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降 或消失的现象。
荧光熄灭剂：能够引起荧光强度降低或消失 的物质。
（3）pH值： 荧光物质为弱酸弱碱，酸度的改变 会导致荧光物质分子结构改变，使荧光 效率改变。 （4）荧光熄灭剂：荧光熄灭剂的存在会 引起荧光分子荧光强度减弱或消失。
2）标准比较法
若样品数量少，可用标准比较法测定
Cs
Cx Cs Cx
=
Is
Ix Is -If0 Ix -If0
Cx =
Ix
Is Ix -If0 Is -If0
Cs
=
Cx =
Cs
第四节
分子荧光分析的应用和技术
荧光分析的特点
（1）灵敏度高 （2）选择性强 （3）试样量少 缺点：应用范围较小。
一、无机物的分析
(2) 共轭效应
分子的共轭效应越强，荧光效率越高，荧 光发射波长越大。
化合物
苯
激发波长 发射波长 （λ ex/nm） （λ em/nm） 0.10 205 278 0.18
0.29
f
联二苯
萘
245
286
316
321
蒽
并四苯
0.46
0.60
365
390
400
480
(3)分子刚性共平面结构
共平面：分子结构处于一个平面上。 平面结构的分子比非平面的分 子荧光效率高
一、基本装置及主要部件功能
光 源 单色器
激发单色器
ex
I0
Ia 样品池 If 单色器
发射单色器
It
em
记录仪 检测器
1. 光源
作用：提供稳定、发射强度大的辐射
常见光源：
①荧光光度计，以溴钨灯(300～700nm)为光源。 ②荧光分光光度ຫໍສະໝຸດ Baidu，以氙灯(250～600nm)为光源。
2. 单色器
第二节
影响分子荧光的因素
1. 荧光效率f
发射荧光分子数 f 被激发分子总数
Or:
发射光量子数 f 吸收光量子数
f 表示分子产生荧光的能力。
荧光效率与激发态能量释放过程的 速率常数有关:
f
k f ki
kf
k -荧光发射过程速率常数
f
k -各种无辐射跃迁速率常数之和
i
（1）凡是使分子荧光发射几率增大的因素，
都会使分子的f ↑，If ↑ 。
（2）凡是使外传移（碰撞）几率增大、使分
子磷光发射（体系间跨越）几率增大的因素，
都会使分子的f ↓，If ↓ 。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，体系间跨越 的速率常数小，有利于荧光产生。 （2）共轭效应：提高共轭程度有利于增加荧光效率 并产生红移。 （3）刚性共平面结构：增大分子共轭程度，降低分 子振动，故增加荧光效率。
刚性：分子刚性越强，荧光效率越高
H C C
H
H C C H
1，2-二苯乙烯 （顺式，非平面） 无荧光
1，2-二苯乙烯 （反式，平面） 强荧光
刚性分子：物质分子共平面大，使分
子振动减小的分子。
C H2
联二苯
芴
f = 0.2
f = 1.0
使分子共平面增大的方法：
引入某些基团、氧环形成封闭环
(1)跃迁类型： π* →π和π* → n
π* π π* n
π*→π比π*→n跃迁的荧光效率高
原因：
1. π→π* 跃迁比n→π* 跃迁的εmax 大 102～103倍。 2. π*→π跃迁的寿命（10-7 ～ 10-9s）比 π*→n跃迁的寿命（10-5 ～ 10-7s）短。
3. π*→π跃迁的能量差比π*→n跃迁的 能量差大（∆Eπ*→π > ∆Eπ*→n ）。
1. 荧光强度与溶液浓度的关系
Ia I0 If It
If= f·a= f · 0 －It) I (I It=I0· -A 10
If = fI0(1-10-A) = fI0(1-e-2.3A)
2 3 2.3 A 2.3 A I f = f I 0 2.3 A 2! 3!
若A<0.05, 方括号内第一项以后的项可忽略不计：
I f = 2.3 f I0 A
或
I f = 2.3 f I0 cl
对于确定物质、激发波长和I0一定时，荧光强 度与溶液的浓度成正比，即：
I f = kc
2. 分子荧光定量分析方法 1）标准曲线法
配制一系列不同浓度的标准溶液，测定荧 光强度，绘制标准曲线，在相同条件下测量未 知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。
H N N H O
C6H5 C6H5 O
KMnO4 OH-
C6H5 C C6H5 O
苯妥英
二苯酮
2）水解反应
氨苄青霉素：pH=2的酸性溶液中，以甲醛为 催化剂，在90℃下水解成能产生荧光的化合物2,5二酮哌嗪。
H O C C NH NH2 O S CH3 CH3 COOH O H+ H2O NH HN R O