肾活检病理标本的制作方法

肾活检病理标本的制作方法肾活检病理标本的制作方法一光镜标本的制作与染色肾活检组织光镜标本的制作包括固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和染色等步骤，各部依次进行，前一步是后一步的基础。

（一）固定将供光镜检查的肾穿刺组织尽快浸入固定液内，迅速凝固，防止自溶和腐败，使其尽可能地保持与生活状态相似的结构，有利于切片和观察，这是组织固定的目的。

常用固定液有甲醛和乙醇。

1.甲醛应配制成中性甲醛为好，具有穿透力强、固定均匀、被固定组织不收缩而且柔韧的特点，常用10%的溶液。

2.乙醇具有固定和脱水的双重作用。

可以保存组织内的糖类物质和尿酸结晶，但易使组织收缩且不能保存脂类物质，常用其95%的溶液。

3.有时为保存两者的优点，可用FAA混合固定液，其中包括10%甲醛10ml、冰醋酸5ml和95%乙醇85ml，其中冰醋酸具有渗透性强和使组织膨胀的特点，借以抵消乙醇的缺点。

固定液内的组织可置于室温或4℃的环境中保存，绝不可冷冻结冰。

（二）脱水脱水的目的是将经过固定的组织内的水分去除，以便使切片时的支撑物（石蜡）充分进入组织。

最常用的脱水剂是乙醇，为避免脱水过程中组织收缩，必须用逐级升高浓度的乙醇依次浸泡脱水：70%乙醇-80%乙醇-90%乙醇-95%乙醇-无水乙醇。

（三）透明透明的目的是将能与石蜡结合的媒介剂浸入组织，并将不能与石蜡结合的脱水剂（乙醇）置换出来，并使组织透明，为包埋做准备。

1.常用的透明剂是二甲苯。

组织在二甲苯中的时间不宜过长，否则可使组织松脆收缩。

2.氯仿也可用作透明剂，其透明性能较弱，但不会致使组织松脆。

（四）浸蜡浸蜡的目的是是组织内有一定的支撑物，使之具备一定的硬度和韧度，便于切出满意的切片。

常用石蜡的熔点是60-62%，有时为保存组织内的抗原，可用48-50%的低熔点石蜡。

（五）包埋将浸蜡彻底的组织用石蜡包埋成规整的长方形块状物体，便于在切片机上切片。

（六）切片将石蜡包埋块置于切片机切片，厚度以2-3um为宜。

（七）染色1.脱蜡：先将石蜡切片置于二甲苯中使石蜡溶解，在用浓度由高到低的乙醇水化：无水乙醇—95%--90%--80%---70%乙醇2.冲洗：再用自来水或蒸馏水冲洗即可染色。

3.染色4.脱水和透明：用浓度递增的乙醇脱水：70%--80%--90%--95%--无水乙醇，之后用二甲苯透明，最后滴加树胶封片。

常用染色：1.★HE染色（hematoxylin-eosin staining）：（1）Harris苏木精染液染色7min。

（2）自来水冲洗多余染液。

（3）1%盐酸乙醇分化数秒，使细胞核显蓝紫色。

（4）自来水中充分洗涤。

（5）浸入1%氨水中数秒，至返蓝。

（6）用自来水和蒸馏水冲洗。

（7）1%伊红染色3min左右。

结果：细胞核呈紫蓝色，细胞质、基底膜、胶原纤维、肌纤维呈粉红色。

（HE染色可充分显示肾小球的细胞增生，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润，但不能区分肾小球的内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞种类。

可很好的显示肾小管上皮细胞的损伤和肾间质水肿以及炎症细胞浸润。

）2.★PAS染色(periodic acid-Schiff reaction)（1）1%过碘酸水溶液染色10min，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基。

（2）蒸馏水洗去过碘酸。

（3）Schiff试剂反应15min，使醛基与Schiff试剂结合，形成紫红色产物。

（4）0.5%亚硫酸氢钠处理3次，每次2min。

（5）流水冲洗5-10min。

（6）用苏木精染液复染细胞核。

（7）水洗或1%盐酸乙醇分化。

结果：细胞核呈蓝色，肾小球和肾小管基底膜、细胞质、肾小球系膜基质、胶原纤维和肌纤维等呈红色。

（PAS与HE染色一样可显示肾小球内的细胞增生和炎症细胞浸润，因其可很好地显示基底膜，故可依细胞的位置区分肾小球的内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞。

可观察基底膜是否增厚、皱缩和毛细血管塌陷。

可观察肾小囊和肾小管基底膜是否增厚。

还可观察肾小球硬化、系膜基质增生。

）3.★过碘酸六胺银（periodic acid-silver methenamine,PASM）（1）1%过碘酸水溶液染色10min。

（2）自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗。

（3）浸入5%铬酸（三氧化铬）水溶液40min。

（4）用1%亚硫酸钠溶液浸泡，以除去铬酸。

（5）自来水冲洗数次，再用蒸馏水洗3-4次。

（6）浸入加热至55-60℃的六胺银溶液20min，在光镜下观察监视，直至基底膜呈黑色为止。

切勿接触金属器械。

（7）蒸馏水洗4次。

（8）浸入0.2%氯化金水溶液1-2min。

（9）蒸馏水洗3次。

（10）浸入5%硫代硫酸钠水溶液1-2min。

（11）自来水和蒸馏水各洗数次。

（12）用HE染色复染。

结果：肾小球、肾小管和肾血管的基底膜、网状纤维和IV型胶原呈黑色，细胞核呈蓝黑色，背景呈粉红色。

对于观察基底膜，PASS染色优于PAS染色，膜性肾病的基底膜的钉突形成，淀粉样变性肾病的基底膜的睫毛状改变、膜增生性肾小球肾炎的基底膜的双轨和多轨改变、肾小球系膜溶解等必须用PASM染色观察。

新月体形成中的基底膜断裂、血管炎中的动脉内膜和弹力纤维的变化也应用PASM染色。

此外，细胞核也是亲银的，所以细胞核分裂、肾小管炎也可用PASM染色法观察。

4.★马松三色染色（M asson’s trichrome staining）----此法综合了Masson和Mallory两种染色方法的优点，又加固深红（fast crimson）染料而成。

（1）浸入Bouin液10min。

（2）流水冲洗5min，再用蒸馏水洗。

（3）天青石蓝染色5min。

（4）自来水洗3次，再用蒸馏水洗。

（5）Mayer苏木精染液染色5min。

（6）盐酸乙醇分化，流水冲洗5min，再用蒸馏水洗。

（7）浸入染液I（丽春红-酸性复红-固深红）5-10min。

（8）浸入1%醋酸溶液洗1次，蒸馏水洗3次。

（9）浸入染液II（5%磷钨酸）30s-1min。

（10）浸入染液III（甲苯胺蓝或亮绿）2min。

结果：细胞核呈红色，免疫复合物呈红色，基底膜呈浅蓝色，III 型胶原纤维呈蓝色或绿色（染色液III中若为甲苯胺蓝，则呈蓝色；若为亮绿，则呈绿色）该法的优点是显示各部位的免疫复合物，呈红色，或称嗜复红蛋白。

可区分肾间质水肿和肾间质纤维化（III型胶原），前者呈淡蓝色或绿色，后者先深蓝色或绿色，并可见蓝色或绿色胶原纤维。

5.PASM和马松三色混合染色此法为PASM和马松三色两种染色方法的叠加染色。

即在PASM染色的HE复染前，再加马松三色染色。

结果：肾小球、肾小管、肾血管基底膜、网状纤维和IV型胶原呈黑色，细胞核呈蓝黑色，背景呈粉红色，免疫复合物呈红色、III型胶原呈蓝色或绿色。

由于基底膜可清楚而准确地显现，所以免疫复合物的定位更为精确，而且对肾小球内增生的胶原成分可区分III型（蓝色或绿色）和IV 型（黑色）。

6.Lendrum纤维蛋白染色（1）浸入Bouin液10min。

（2）流水冲洗2min，再用蒸馏水洗。

（3）天青石蓝染色5min。

（4）自来水洗3次，再用蒸馏水洗。

（5）Mayer苏木精染液染色5-10min。

（6）盐酸乙醇稍分化，流水冲洗5min，再用蒸馏水洗。

（7）浸入酸性复红染液5min。

（8）蒸馏水洗2次。

（9）盐酸乙醇稍分化1min，蒸馏水洗2次。

（10）浸入MacFarland染液1min，蒸馏水洗3次。

（11）浸入甲苯胺蓝染液1min。

（12）蒸馏水洗3次。

（13）HE复染。

结果：细胞核呈蓝黑色，纤维蛋白样坏死和血栓的纤维蛋白呈深红色，基底膜呈蓝色，免疫复合物呈浅粉色。

附：染液配制方法1．Harris苏木精染液配方：苏木精1g无水乙醇10ml十二水合硫酸铝钾（钾明矾）20g蒸馏水200ml氯化汞0.5g2．水溶性伊红染液配方：伊红0.5-1g蒸馏水99ml3 . Schiff试剂配方：将200ml蒸馏水煮沸，冷却至90℃，慢慢加入碱性复红1g。

搅拌并再次煮沸5min，使其完全溶解。

冷却至50℃时过滤，再加入无水亚硫酸氢钠（NaHSO3）1g并搅匀。

置入遮光瓶内，放在4℃冰箱保存备用。

4. 六胺银染液配方：2%硝酸银水溶液3ml3%六亚甲基四胺液（乌洛托品）25ml5%硼砂（四硼酸钠）溶液2ml5．天青石蓝染液配方：硫酸铁胺10g蒸馏水100ml天青石蓝1g加热煮沸3min，冷却后过滤，加甘油28ml备用。

6. Mayer苏木精染液配方：结晶苏木精4g蒸馏水1000ml碘化钾0.3g铵明矾（十二水合硫酸铝铵）或钾明矾50g枸橼酸（柠檬酸）1g水合氯醛75g加热使明矾溶解，再加入苏木精，溶解后再加枸橼酸、碘化钾及水合氯醛，摇荡使之全部溶解，呈紫红色，用前过滤。

7. 染液I配方：丽春红 3.5g酸性复红 1.5g固深红1g橘黄G 1.65g蒸馏水500ml醋酸5ml8. 染液II：5%磷钨酸水溶液9. 染液III配方：甲苯胺蓝或亮绿 2.5g蒸馏水100ml冰醋酸2ml。