免疫荧光组织化学
检验科免疫组化常见检测与分析方法
检验科免疫组化常见检测与分析方法免疫组化技术是一种利用免疫学原理，通过检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达水平和位置的方法。
在医学检验科中，免疫组化技术被广泛应用于疾病的诊断、治疗及预后评估。
本文将介绍一些常见的免疫组化检测与分析方法。
一、免疫组化染色法免疫组化染色法是免疫组化技术中最常用的方法之一。
它通过采用免疫荧光、酶标记、金标记或放射性标记等技术，将特定抗原与特异性抗体结合，并通过染色或荧光的方式来显示其位置和表达水平。
免疫组化染色法广泛应用于各种疾病的诊断，如肿瘤标记物的检测、感染性疾病的诊断等。
二、免疫组织化学法免疫组织化学法是一种在组织切片上进行免疫组化染色的方法。
它通过对切片进行蛋白质抗原的恢复处理和抗体的特异性结合，来检测和显示抗原在组织中的位置和表达水平。
免疫组织化学法主要应用于病理学领域，帮助医生确定疾病的类型和分级。
三、免疫荧光法免疫荧光法是利用特异性抗体与抗原结合后，在显微镜下观察抗原在组织或细胞中的分布情况和表达水平的技术。
免疫荧光法具有高灵敏度和高特异性的优点，被广泛应用于自身免疫性疾病、感染性疾病等的诊断。
四、免疫电镜法免疫电镜法是一种在电镜下观察和检测抗体与抗原结合的方法。
它通过在样品上标记抗体或抗原，然后利用电镜来观察并获得高分辨率的图像。
免疫电镜法主要用于对超微结构进行研究和观察，是研究细胞和组织的重要手段。
五、免疫组化信号放大技术免疫组化信号放大技术是一种能够放大免疫染色信号并提高染色效果的方法。
常见的免疫组化信号放大技术包括多聚酶法、银增强法、酶蛋白复合物法等。
这些技术在免疫组化检测中可以提高检测的灵敏度和准确性。
免疫组化技术因其高度敏感、高特异性和定量分析的优势，成为了疾病诊断与治疗中不可或缺的重要方法。
随着技术的发展和创新，免疫组化技术将在临床医学中发挥越来越重要的作用。
综上所述，本文介绍了免疫组化检测与分析的常见方法，包括免疫组化染色法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫电镜法以及免疫组化信号放大技术。
免疫荧光 免疫组化 实验技术
1甲醛（formaldehyde）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。
易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。
用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。
2 乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。
固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二纳（Na 2HPO4）13g。
此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。
4 AF液（混合固定液）95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。
也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5 ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。
以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。
IF免疫细胞化学和免疫荧光实验载玻片/盖玻片处理聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。
无菌水冲洗盖玻片（3次，每次5分钟）。
可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。
在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。
磷酸盐缓冲液（ PBS ）进行简短的冲洗。
第一步：细胞固定用预冷的甲醇、丙酮（ 1-10分钟），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室温（或者-20 ℃)固定细胞片15分钟。
用预冷的PBS冲洗细胞片两次。
透化：如果目的蛋白是胞内表达，透化细胞非常重要。
注：丙酮固定标本不需要透化。
用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。
免疫组织化学法
免疫组织化学法免疫组织化学法是一种生物学技术，它可以辅助研究人员检测和鉴定细胞内和细胞外免疫分子的存在和表达。
这种技术为识别细胞和分子的特定结构以及同步地观察和分析细胞和分子之间的动态变化，为生物学家的研究提供了Python的灵活性。
为了达到这一目的，研究人员会使用各种技术，包括免疫组织化学、免疫荧光技术、免疫共聚焦显微镜、免疫贴片技术等。
免疫组织化学是一种利用抗体来检测细胞内或细胞外抗原的技术，它与其他免疫技术不同，例如免疫荧光，因为它可以在宏观尺度上看到目标抗原的分布形态和配分情况。
同时，它能够通过观察特定位点的抗原表达水平来识别细胞功能的改变情况。
免疫组织化学法的技术原理是首先将一种特定的抗体与一个细胞样本中的抗原结合起来，然后通过采取特定技术（如光学显微镜）来观察结合后的细胞样本，从而使抗原体现出明显的可视化特征。
抗体可以检测各种免疫分子，如抗原、抗体、抗原抗体复合物、细胞因子和其他复杂结构。
它们可以发挥自身的特异性，以催化特定类型的生物学反应，从而检测和识别特定的免疫分子。
另外，免疫组织化学的另一个优势是，它可以同步地观察和分析细胞和分子之间的动态变化情况，从而选择有效的分子，有助于确定特定分子在调节细胞状态和促使细胞功能的过程中的作用。
例如，研究人员可以通过识别细胞及其周围的抗原在细胞凋亡、炎症损伤和免疫细胞活动过程中的调节活动，从而更深入地了解他们所研究的特定疾病。
最后，免疫组织化学可以有效地帮助研究人员检测并观察细胞内外免疫分子的存在和表达，有助于研究人员更深入地了解细胞及其周围抗原在各种疾病发生发展过程中的调节作用，为临床医学提供参考。
免疫组织化学是一种多种技术的变种，它的根源可以追溯到20世纪50年代末水平的免疫学技术。
近年来，由于技术进步和设备发展，该技术受到了越来越多的研究者的关注，在生物学研究中发挥着日益重要的作用。
虽然免疫组织化学仍然只是一种新兴的技术，但它有望在临床中发挥重要作用，对疾病的诊断和治疗提供参考。
排雷攻略：一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片
排雷攻略：⼀⽂教会你免疫组化、免疫荧光如何制⽚看⽚最近带着新进门的研⼀师妹做实验，师妹问了三个问题：1、免疫组化和免疫荧光的区别？2、这两种实验该在什么情况下选择？3、组织是不是只能做免疫组化，细胞是不是只能做免疫荧光？4、免疫荧光为什么要做DAPI染⾊？我听完之后笑了，这种思考的态度是好的，但其实，师妹问的这⼏个问题就是⼀个问题。
归根结底，涉及到“免疫”⼆字总是离不开抗原抗体反应的，⼆者都属于免疫检测技术⼿段，⽽免疫组化和免疫荧光两项技术都可以应⽤在组织和细胞⽅⾯，前者采⽤的是化学发光的⽅法，后者是荧光。
因为我们在⽂献中看到的，很多⼈都会选择做组织的免疫组化、细胞的免疫荧光，所以这就给初⼊实验室的新⼿们带来了误区。
其实⽹上已经有很多详细的操作步骤，所以⼩六⼉今天想为各位新⼿朋友们总结⼀下我认为的免疫组化和免疫荧光制⽚看⽚的⼩技巧，帮助⼤家排雷区，同时也提出⾃⼰的⼀些疑问，希望能得到解答（因为本⼈只做过组织的免疫组化和细胞的免疫荧光，以下内容以这两⽅⾯为主，内容若有⽋缺，欢迎⼤家补充）。
免疫组化1、取材时要尽量去除⾎液的⼲扰：⼩⿏⿇醉后，从左⼼⽿插⼊针头，⼼尖处剪开⼀个⼩⼝，然后将PBS缓慢打⼊⼼脏中，缓慢跳动的⼼脏会将PBS运送⾄全⾝。
50ml的PBS⽤量对于Balb/c或昆明⼩⿏的体积⽽⾔就已⾜够，这⼀步骤对于像肺、肝和脾脏这样⾎管丰富的脏器取材极为重要。
2、取材时要尽量做到表⾯积⼤、厚度⼩：理想的取材厚度是2mm，这样的尺⼨可以让后续的固定、脱⽔等操作达到理想的效果。
器材选择上，⼿术⼑和超市购买的⼑⽚都可以，只要⼑⽚锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。
因为脏器的表⾯都是弧形，并且质地很软，如果你直接取材，第⼀是不好切，第⼆是弧形的⼀⾯肯定是厚度超标，所以这⾥建议各位将组织置于碎冰上后，沿着长轴在横切⾯处再切⼀⼑取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。
3、取材后的组织需⽴即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗原。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学研究中常用的实验技术方法。
它们都是通过利用抗体与目标抗原的特异性结合来检测和定位特定蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
尽管它们的目的相似，但在具体实验步骤、原理和应用方面存在一些差异。
本文将对免疫组化法和免疫荧光染色法的区别进行详细阐述，以帮助读者更好地理解这两种常见实验技术。
一、实验步骤和原理1.免疫组化法：免疫组化法是一种通过使用抗原与特异性抗体相结合的技术，将抗体标记物（一般为酶）转化为可见信号，并用于检测和分析目标分子在细胞或组织中的表达情况。
其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合、再次洗涤和显色等。
2.免疫荧光染色法：免疫荧光染色法是利用荧光标记的抗体来检测和定位目标抗原的一种技术。
其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合和荧光染色等。
从实验步骤和原理上看，免疫组化法和免疫荧光染色法在很多方面是相似的。
它们都需要进行对抗原的取样和固定等预处理步骤，以及对目标抗原的特异性抗体进行结合。
然而，主要的区别在于信号检测和可见性。
免疫组化法使用酶标记物并在显色反应中产生可见的染色物质，而免疫荧光染色法则通过荧光标记的抗体在荧光显微镜下进行直接可视化。
二、应用领域1.免疫组化法：免疫组化法广泛应用于细胞生物学和组织学研究中，常用的应用领域包括但不限于肿瘤标记、蛋白质表达和定位、细胞内分子信号通路等。
2.免疫荧光染色法：免疫荧光染色法在细胞和组织研究中具有重要作用。
它常用于细胞活力检测、细胞分子定位、免疫分型、细胞凋亡检测等。
免疫组化法更适合定性分析和形态学研究，而免疫荧光染色法则更适合定量分析和定位研究。
在实际应用中，研究者可以根据自己的研究目的选择合适的方法，或者根据具体需求结合两种方法进行分析。
三、我的个人观点和理解免疫组化法和免疫荧光染色法作为两种常见的免疫化学实验技术，都在生物医学研究领域发挥着重要的作用。
IF实验步骤
免疫荧光组织化学实验步骤（石蜡切片，SABC法，博士德）第一天：1. 二甲苯Ⅰ脱蜡 20min2. 二甲苯Ⅱ脱蜡 15min3. 二甲苯Ⅲ脱蜡 10min（二甲苯脱蜡时间视温度而定，温度高时间就短，温度低则时间就长）4. 无水乙醇Ⅰ 5min5. 无水乙醇Ⅱ 4min6. 95％酒精 2min7. 90％酒精 1min8. 80％酒精 1min9. 70％酒精 1min10. 石蜡切片过完酒精后，将其浸入蒸馏水中2min。
11.我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用中高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。
到时间后将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。
（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）12. 甩干玻片，用免疫组画笔在组织周围画圈，然后滴加稀释的正常血清封闭，室温30min，以减少非特异性染色。
13. 甩去封闭液，不洗。
每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒，4℃过夜；第二天：14. 37℃复温30min（根据具体情况确定），PBS冲洗3次，每次3min；15. 在玻片上滴加稀释的生物素化二抗，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗去二抗，3min×3次；16. 在玻片上滴加稀释的SABC-FITC(或SABC-CY3)，湿盒中20-37℃孵化30min，PBS洗5min×4次；17. 滴加 Hoechst 33342（或DAPI）避光孵育5min，可对标本进行染核，PBS 3min×4次洗去多余的Hoechst 33342（或DAPI），用滤纸擦去标本外的PBS；（选做）18. 用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察。
免疫组织化学染色过程中出现问题及对策
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
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免疫荧光组织化学
免疫荧光组织化学是一种常用的生物学技术，它可以用来检测组织中的蛋白质、细胞和分子等。
这种技术利用荧光染料和抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和分布情况。
在医学、生物学和生物技术等领域中，免疫荧光组织化学被广泛应用。
免疫荧光组织化学的原理是利用抗体与特定抗原结合的特异性来检测目标分子。
抗体是一种特异性蛋白质，它可以识别并结合到特定的抗原上。
荧光染料是一种能够发出荧光的化学物质，它可以与抗体结合并标记目标分子。
当荧光染料与抗体结合到目标分子上时，荧光染料就会发出荧光信号，从而可以检测到目标分子的存在和分布情况。
在免疫荧光组织化学中，首先需要制备组织切片。
组织切片可以通过组织固定、切片和染色等步骤来完成。
然后，需要选择适当的抗体和荧光染料。
抗体的选择应该基于目标分子的特异性和抗体的特异性。
荧光染料的选择应该基于其荧光强度、稳定性和特异性等因素。
接下来，需要将抗体和荧光染料加入到组织切片中，使其与目标分子结合。
最后，使用荧光显微镜观察组织切片，并记录荧光信号的分布情况。
免疫荧光组织化学在医学领域中有着广泛的应用。
例如，在肿瘤学中，免疫荧光组织化学可以用来检测肿瘤细胞中的特定蛋白质，从
而帮助医生诊断和治疗肿瘤。
在免疫学中，免疫荧光组织化学可以用来检测免疫细胞中的特定蛋白质，从而帮助研究人员了解免疫系统的功能和调节机制。
在神经科学中，免疫荧光组织化学可以用来检测神经元中的特定蛋白质，从而帮助研究人员了解神经系统的结构和功能。
除了在医学领域中的应用外，免疫荧光组织化学还在生物学和生物技术领域中有着广泛的应用。
例如，在基因工程中，免疫荧光组织化学可以用来检测转基因生物中的特定蛋白质，从而帮助研究人员了解转基因生物的性质和特点。
在生物学研究中，免疫荧光组织化学可以用来检测细胞中的特定蛋白质，从而帮助研究人员了解细胞的结构和功能。
免疫荧光组织化学是一种重要的生物学技术，它可以用来检测组织中的蛋白质、细胞和分子等。
在医学、生物学和生物技术等领域中，免疫荧光组织化学被广泛应用。
通过免疫荧光组织化学技术，我们可以更好地了解生物体内的结构和功能，从而为医学和生物学研究提供更多的信息和帮助。