靶向超声分子成像在卵巢癌诊断中的研究进展

靶向超声分子成像在卵巢癌诊断中的研究进展卵巢癌的病死率位居妇科恶性肿瘤之首位[1]，因其发病隐匿、进展迅速，易转移和复发，至今缺乏有效、高特异性的早期诊断方法，加上卵巢癌对化疗易产生耐药，中晚期患者的5年生存率仅为25％-30％[2]，而相比早期卵巢癌患者，其生存率却能达到90％[3]。

因此，卵巢癌的早诊早治非常重要。

目前卵巢癌的诊断方法主要包括血清肿瘤标志物检测和影像学检查手段，如超声、CT、MRI等，近年国内外采用筛查以求早期诊断和治疗卵巢癌，但患者死亡率仍未能明显降低[4]。

超声分子成像技术被誉为超声领域的第三次革命[5]，可有效提高超声对病灶区血管的检测能力，使超声在恶性肿瘤的早期诊断方面得到更进一步的发展。

本文就靶向超声分子成像在卵巢癌早期诊断中的研究进展进行综述。

一、超声分子成像技术概述分子影像学是联合医学影像技术和分子生物学所发展起来的新技术，引入以造影剂为成像基础，在分子或细胞水平观察、分析生物体内某一病理、生理过程，或疾病某一阶段具有特异性的分子标志物表达差异(如肿瘤特异性抗原、血管生成因子和凋亡标志物等)的影像学方法[6]。

就肿瘤而言，分子成像能在肿瘤尚未出现典型临床症状时，检测到早期肿瘤的生物学特性，如癌前分子改变、基因变化、肿瘤细胞标志物、生长动力学等[7]，最终达到早期诊断的目的。

分子影像学包括有：磁共振分子成像、单光子发射计算机断层成像术和正电子发射断层成像术、靶向超声分子成像等[8]。

靶向超声分子成像技术是将特异性配体或抗体，连接到超声造影剂表面，通过配体与受体结合的方式，使造影剂特异性结合并长时间积聚于靶组织，从而通过观察靶组织在分子或细胞水平的特异性显像效果，达到能够反映病变组织在分子基础上的变化[9]。

靶向超声分子成像具备很多优点，如：①无创、无辐射、无毒性；②能实时、动态、可多次重复地对靶组织进行观察[10]；③超声分子探针可设计单靶点、多靶点和多模态形式。

多年临床应用和实践发现，应用传统的影像学检查，普通造影剂因缺乏对病变组织的特殊亲和力，不能有效驻留于靶组织，只能在短暂的动脉相中使靶组织或靶器官产生一过性增强，所以对疾病诊断的特异性较差[11]。

利用超声技术从分子水平无创性早期评价组织和器官的病理改变，为超声成像在疾病方面的应用开辟了广泛的应用前景。

目前国际上应用靶向超声分子技术在肿瘤新生血管、血栓、炎症等方面的研究已经取得了很好的成果[12]。

超声分子成像在很大程度上依赖于分子探针的性能[13]。

二、靶向超声造影剂概述靶向性微泡造影剂是现在研究的热点[14]，其以普通的超声微泡为基础，对微泡造影剂的表面物质材料进行改造及化学修饰，使靶向物质如抗体、基因等连接在其表面，通过机体的免疫反应或生物反应，实现与不同病变组织、器官中的不同特异性抗原分子或受体进行高效且直接地靶向结合，使后者通过血液循环或者穿过血管内皮间隙，能够靶向性聚集并长时间滞留于靶组织或靶器官中，这种方式可使微泡免于吞噬细胞的破坏，因此其具有高水平的特异性和靶向性[15]。

目前，主要通过被动性靶向和主动性靶向两种机制实现靶向性目的。

被动性靶向是通过机体本身固有的防御机制——吞噬细胞，主要是巨噬细胞，在调理素的协同作用下，来实现对异物的清理[16]。

主动性靶向是通过在微泡表面连接有靶向性的配体来实现的[17]，具有高度的特异性和靶向性，同时也避免了吞噬细胞对超声微泡的破坏。

将配体连接到微泡表面有两种基本方法：通过“抗生物素蛋白／生物素复合体”或者直接的共价键连接[18]。

“抗生物素蛋白／生物素复合体”是最有效的靶向结合系统，此非共价结合法尤其适用于单克隆抗体等大分子配体，因其不能耐受微泡制备过程[19]。

由于免疫原性阻碍了“抗生物素蛋白／生物素复合体”在人体的应用[20]，共价键结合方法是更为理想的方法。

共价键结合能在微泡壳形成前或形成后完[18]。

共价结合方法适用于小分子有机配体，如肽链、碳水化合物、激素及维生素等，主要通过离子键、物理吸附、耦联剂或桥连剂介导结合等机制，实现配体与微泡的连接，不同方法的选择主要取决于配体自身的化学特性。

近年来出现的纳米级超声造影剂，极大推动分子成像技术的发展。

纳米级造影剂指粒径在纳米尺度( < 1000 nm) 范围内的造影剂。

纳米粒本身表面积相对较大,吸附能力强,具有良好的生物亲和性;体积微小,稳定性较强,可在血液循环中存留更长时间[21]。

肿瘤新生微血管壁缺乏基底膜和平滑肌结构，血管通透性明显升高, 在无任何外力的作用下，肿瘤新生血管内皮间隙可扩大，其管壁的最大孔径约380-780 nm[22]。

与常规微米级造影剂相比，纳米级造影剂具有更强的穿透力。

常规造影剂微泡不能透过血管壁,而纳米级造影剂可以穿透血管内皮到达血管外靶组织,实现血管外显像,特别是在疾病状态下(如肿瘤等) ，从而区分病理组织和周围正常组织[23]。

如将特异性配体连接到纳米级微泡的表面，即可穿过血管与相应的肿瘤细胞受体结合,从而达到特异性增强肿瘤超声信号或靶向治疗的目的[24]。

Hughes 等[25]将大剂量的纳米粒注射入猪体内,探测到混有造影剂的猪血与单纯猪血的声衰减并无明显差别;只有众多微球聚集到目标组织或细胞膜时,才能产生明显增强的回声信号。

三、卵巢癌靶向标志物的选取靶向超声造影剂的构建思路是将特异性结合肿瘤组织细胞表面呈高表达的生长因子或者受体的配体连接在超声微泡表面。

为了达到靶向标记卵巢癌细胞的目的，需选取在卵巢癌细胞表面呈高表达，而在良性肿瘤及正常细胞中呈低表达或不表达的物质作为靶点。

相关文献报道，卵巢癌有多种血管内皮如血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)、整合素αVβ3，和组织细胞上的受体如叶酸受体（FR）、促黄体生成激素释放激素(LHRH)、CA-125，呈高表达，而在正常组织或细胞表面表达较少或不表达[26]。

目前在卵巢癌诊治中应用最成熟的分子诊断技术是血清CA-125的检测[27]，CA-125是卵巢上皮癌诊治过程中首选的肿瘤标志物，主要应用于卵巢癌的诊断、治疗后的病情监测及预后评估，是目前临床应用最广泛的卵巢癌分子标志物。

除此以外，叶酸受体在正常人卵巢上皮组织中呈低表达，而在一些上皮类肿瘤，如卵巢癌、子宫内膜癌等中呈高表达[28]，尤其叶酸受体α呈高表达时，对于特异性诊断该上皮类肿瘤具有重要意义[29]。

有相关研究表明，利用αVβ3与卵巢癌的发生、发展有关，而在良性卵巢肿瘤中，整合素αVβ3呈不表达或低表达[30]，因此Jin等证实了以αVβ3作为靶点在卵巢癌分子成像中起到很好的效果[42]。

四、卵巢癌靶向微泡的血管内显影新型微泡造影剂具有更好的稳定性、更集中的粒径分布、更微弱的后方声衰减、在体内更长的存留时间等特点，在此基础上，将特异性配体(如抗体，多肽等)连接到微泡造影剂表面，当微泡造影剂到达靶组织或靶器官时，与相应受体结合后，该靶向造影剂既可抵抗毛细血管内血流的冲击，又可利用气体与组织不同的信号特征，来实现明显增强的靶组织信号与清晰背景的高对比率达到靶向分子显影的目的[31]。

Deshpande等用VEGFR-2、整合素和内皮素(endoglin)标记超声微泡造影剂来评估卵巢癌血管标记物的表达，对卵巢癌异种移植的裸鼠进行超声造影，结果提示随着卵巢癌肿瘤体积的增大，标记物结合得越多[32]。

Willmann等则将整合素连接抗菌肽靶向超声微泡造影剂对卵巢癌血管进行超声造影，结果显示在卵巢癌小鼠上，连接小分子肽的超声微泡造影剂信号明显强于连接大分子抗体的超声微泡造影剂[33]。

五、卵巢癌靶向微泡的血管外显影由于大多数肿瘤的血管内皮间隙可增宽至380-780 nm，靶向纳米级超声造影剂由于其较小的粒径，具有穿越血管内皮间隙的能力，因此与常规微米级超声造影剂相比，纳米级超声造影剂具有更强的穿透力[34]，从而实现超声早期诊断血管外病变的能力[46]，突破了常规微米级超声造影剂仅能血池内显像的局限性。

Xing等制备了携带叶酸配体的微泡，体外寻靶能力试验结果提示，携带有叶酸配体的靶向微泡和人卵巢癌SKOV-3细胞可高效结合，这充分说明了携带了叶酸配体的靶向微泡与对叶酸受体呈高表达的人卵巢癌SKOV-3细胞之间有很强的亲和力，这为超声微泡靶向对叶酸受体呈高表达的卵巢癌的早期、特异性诊断提供了新的方法[35]。

Gao等采用靶向微泡技术，对超声微泡携带化疗药物后，经静脉注入该靶向造影剂，进行超声造影和靶向化疗治疗后，结果显示纳米级的微泡能溢出血管间隙，聚集在卵巢癌组织中，既提高了靶组织显影，又达到靶向治疗的效果[36]。

六、问题与展望目前运用超声微泡早期诊断并介导靶向治疗卵巢癌仍处于摸索阶段，相关研究尚停留在细胞和动物实验阶段，而且作为配体的抗体在人体内易产生免疫反应，多肽类物质对人体易产生过敏反应，许多实际技术问题尚有待解决，如靶向超声微泡的稳定性、靶向性等，都是目前需要进一步解决的问题。

总之，靶向超声分子成像的应用涉及多学科，如化学、生物医学、免疫学等知识，需要多学科的交叉联合，来实现超声分子影像对疾病的早期诊断，相信靶向超声微泡造影剂会在肿瘤的诊断方面具有极大的研究价值和临床应用潜力。

参考文献[1] Lech A, Daneva T, Pashova S, etc. Ovarian cancer as a genetic disease. Front Biosci(Landmark Ed), 2013, 18: 543-563．[2] Liu CM. Cancer of the ovary. N Engl J Med. 2005, 352(12):1268-1269.[3] 宋金国, 张修石. 卵巢癌的影像学检查及进展. 实用肿瘤学杂志, 2009, 23(1): 86-88．[4] Engler DA, Gupta S, Growdon WB, etc. Genome wide DNA copy number analysis of serous type ovarian carcinomas identifies genetic markers predictive of clinical outcome. PLoS One, 2012, 7(2): e30996．[5] Morawski AM, Lanza GA, Wickline SA. Targeted contrast agentsfor magnetic resonance imaging and ultrasound. Curr Opin Biotechnol, 2005, 16(1)：89-92．[6] Wright WH Jr, McCreery TP, Krupinski EA, etc. Evaluation of new thrombus-specific ultrasound contrast agent. Academic Radiology, 1998, 5(Suppl 1): S240-S242.[7] Wagenaar DJ, Weissleder R, Hengerer A. Glossary of molecular imaging terminology. Acad Radiol, 2001, 8(5): 409-420．[8] Massound TF, Gambhir SS. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev, 2003, 17(5): 545-580.[9] Klibanov AL. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Invest Radiol, 2006, 1(3): 354-362.[10] Hauff P, Reinhardt M, Foster S. Ultrasound contrast agentsfor molecular imaging. Handb Exp Pharmacol, 2008, 185(1): 223-245.[11] D'Arcy TJ, Jayaram V, Lynch M, etc.Ovarian cancer detected non-invasively by contrast-enhanced power Doppler ultrasound. BJOG, 2004, 111(6): 619-622.[12] Lindner JR, Song J, Xu F, etc. Noninvasive ultrasound imaging of inflammation using microbubbles targeted to activated leukocytes. Circulation, 2000, 102(22)：2745-2750．[13] Lammers T, Kiessling F, HenninkWE, etc.Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress. J Control Release, 2012, 161(2): 175-187.[14]郭娟, 常淑芳, 孙江川, 等. 超声微泡造影剂用于卵巢癌的研究进展. 实用妇产科杂志, 2010, 26(5): 345-347.[15] 黄瑞珠, 宾建平. 靶向超声微泡在肿瘤诊断与治疗领域的研究进展. 肿瘤，2009, 29(7): 692-695.[16] Lanza GM, Wiekline SA. Targeted ultrasonic contrast agentsfor molecular imaging and therapy. Curt Probl Cardiol, 2003, 28(12): 625-653．[17] Weuer GE，Lu E，Csikari MM，etc. Ultrasound imaging of acute cardiac transplant rejection with microbubbles targeted tointercellular adhesion molecule-1. Circulation, 2003, 108(2)：218-224．[18] Klibanov AL. Gas filled microbubbles：ultrasound contrast agents for targeted molecular imaging. Bioconjug Chem, 2005, 16(1): 9-17．[19] Avivi Levi S，Gedanken A．The preparation of avidin microspheres using the sonochemical method and the interaction of the microspheres with biotin. Ultrason Sonochem, 2005, 12(5): 405-409．[20] Lindner JR, Song J, Christiansen J, etc. Ultrasound assessment of Inflammation and renaltissue injury with microbubbles targeted to P-selectin. Circulation,2001, 23, 104(17): 2107-2112.[21] Moghimi SM, Hunter AC, Murry JC. Long-circulating andtargeted-specific nanoparticles : theory to Practice. Pharmacol Rev, 2001, 53 (2): 283-318.[22] Oeffinger BE , Wheatley MA. Development and characterizationof a nano-scale contrast agent . Ultrasonics, 2004, 42 (1-9) : 343-347.[23] Lanza GM , Abendschein DR , Hall CS , etc. In vivo molecular imaging of stretch-induced tissue factor in carotid arteries withligand-targeted nanoparticles. J Am Soc Echocardiogr, 2000,13(6) :608-614.[24] Kong G, Braun RD, Dewhirst MW. Characterization of the effect of hyperthermia on nanoparticle extravasation from tumor vasculature. Cancer Ras, 2001, 61(7): 3027- 3032．[25] Hughes MS , Marsh JN , Hall CS , etc. Acousticcharacterization in whole blood and plasma of site2targetednanoparticle ultrasound contrast agent for molecular imaging. J Acoust Soc Am, 2005, 117 (2) :964-972.[26] Vranes HS, Klari6 P, Kuna K, etc. Detection of ovarian cancer by determination of CA125 indifferent patohistologycal types of tumor according to age. Coil Anropol, 2012, 36(2): 425-429．[27] Pignata S, Cannella L, Leopardo D, etc. Follow-up with CA125 after primary therapy of advanced ovarian cancer: in favor ofcontinuing to prescribe CA125 during follow-up. Ann Oncol, 2011,22(Suppl 8): viii40–viii44.[28] Kim D，Gao ZG，Lee ES，et a1．In vivo evaluation ofdoxorubicin-loaded polymeric micelles targeting folate receptors and early endosomal pH in drug-resistant ovarian cancer. Mol Pharm, 2009,6(5): 1353-1362．[29] Chen C，Ke J，Zhou XE，etc. Structural basis for molecular recognition of folic acid by folate receptors. Nature, 2013, 500(7463): 486-489．[30] Hensley HH, Roder NA, O’Brien SW，etc. Combined in vivo molecular and anatomic imaging for detection of ovarian carcinoma-associated protease activity and integrin expression in mice. Neoplasia, 2012, 14(6): 451-462．[31] Scalici JM, Harrer C, Allen A, etc. Inhibition of α4β1 integrin increases ovarian cancer response to carboplatin. Gynecol Oncol, 2014, 132(2)：455-461．[32] Deshpande N, Ren Y, Foygel K, etc. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology, 2011,258(3): 804-811.[33] Willmann JK, Kimura RH. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knott in peptides. J Nuel Med, 2010, 51(3): 433-440．[34] Glassberg H, Kirkatrick J, Farrari VA. Imaging studies in patients with heart failure: current and evolving technologies. Crit Care Med, 2008, 36(1 Supp1): S28-S39．[35] MarxerEE, BrfisslerJ, BeckerA, etc. Development and characterization of new nanoscaled ultrasound active lipid dispersions as eontrastagents. EurJ Pharm Biopharm，2011, 77(3): 430-437．[36] Xing W, Zhigang W, Bing H, etc. Targeting an ultrasound contrast agent to folate receptors on ovarian cancer cell：feasibility research for ultrasonic molecular imaging of tumor cells. J Ultrasound Med, 2010, 29(4): 609-614．[37] Gao Z, Kennedy AM, Christensen DA, etc. Drug-loadednano/microbubbles for combining uhrasonography and targeted chemotherapy. Ultrasonics, 2008, 48(4): 260-270.6。