酶切注意事项及问题

1、建立一个标准的酶切反应

目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。

二、选择正确的酶

不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3’或5’突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的

Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、酶

内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而

定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA

待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至

253页之甲基化相关内容。

五、缓冲液

对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml

的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X 的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。

六、反应体积

内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解

1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。

七、混合

这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！八、反应温度

大部分酶的反应温度为37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°C不等。参看第244

页 Activity of thermophiles at 37°C。

九、反应时间

1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。十、终止反应

如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB 我们使用如下反应终止液：50%的甘油，

50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65°C或85°C，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。

十一、贮存

大部分酶应贮存于-20°C。少部分酶则须在-70°C长期保存。详情请参见相关酶的DATA SHEET 或目录相关部分。

10X BUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能与NEBuffer混

合后保存，否则将会出现BSA沉淀。

十二、稳定性

每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检

测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，

我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°C条件下十分

稳定。高于-20°C条件下稳定性将有所降低。

十三、对照反应

如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以

查明原因。具体方法如下：

将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照

DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明

底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核

酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被

成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和

待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑

制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合

物里的对照DNA也无法被切开。

实验过程中的注意事项：

1、 首先看是单酶切还是双酶切。要是双酶切要注意这

两种酶是否有共用的Buffer。

2、酶的用量最好在40U单位以上，尽可能酶切充

分。

3、酶的用量不要超过总体积的1/10。

4、同时看是否需要用到BSA。

5、酶切时间不要低于2个小时。

6. 酶切进行时，注意酶切温度是否稳定地保持在最佳温

度；酶切时间根据厂家推荐，一般的酶1-2h即可，特别

难酶切的时间可放长，但并不是越长越好，时间太长易

引发部分酶的星号活性, 造成酶切失败。NEB的酶我用过半小时内酶切即可彻底。

酶反应操作时注意事项：

1、基因工程操作是微量操作，试剂昂贵，要细心，准确

地配制所用的试剂。DNA样品和酶用量体积都很少，要注意吸样量的准确性，酶用量不能过多，因酶通常保存在

一定浓度的甘油内，酶用量取得过多，甘油浓度加大反

而抑制酶的反应，通常不应超过1/10 酶反应总体积。

2、当塑料小管在一定温度下水浴进行酶反应时，盖子必

须盖得严密，防止水气出入，影响总体积。

3、酶反应的一切器皿，都要以重蒸水清洗，消毒灭菌，

严防其它酶的污染。

4、要注意酶反应时，加样顺序，最后加酶液，混匀，操

作过程中，一旦吸取好酶溶液，酶应立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。

酶的星号活性

Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是

这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表

现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松

动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通

常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性

的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星

号活性。

概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：

(1)高甘油含量(>5％, v／v)；

(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；

(3)低离子强度(<25 mmol／L)；

(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇

等；

(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，

Zn2+等

连接注意事项

1.与载体连接时，加大目的基因DNA量，以提高与载体的连接