各种表达载体

表达载体

一、原核细胞表达载体

1. pBAD载体:

特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。

请注意:

1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。

2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。

本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:

(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域

SD

P BAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT

A M A E L

TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT

Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域

Pst1

P BAD….TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT

Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111

下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:

pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞

Origami(DE3)内高效表达

2. pCAl-n & pCAl-pelB载体

特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。

此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

(a). Pcal-n

M K R R W K K N F I A V S A A N R F K K I S S S G A L L V P CATATG AAG GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC Nde1

R G S P G I L D S M G R L E L K L R S A GCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCC

BamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111

(b). Pcal-PelB:

Nde1

actggagact cat ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGC

M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P Nco1 Msc1 Sal1

GCC ATG GCC aa ggatcc taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc cgacgcgctggg

A M A * * * * * *

3. pPOW3.0 表达载体

特点: 该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λP R P L热诱导启动子和编码热敏

感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。PelB分泌信

号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。特别提示: 在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。

图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域

Xho1

λP R P L 启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcc tcgagt aatttaccaacactactacgttttaactgaaac aa

RBS Nde1

actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG M K Y L L P T A A A G L L L L A Nco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1

GCC CAG GGC GCC ATG GCC

taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc

A Q P A M A * * * * * *

说明: RBS 为核糖体结合位点; * 为终止密码子

二、真核细胞表达载体

1.pCMVp-NEO-BAN载体

特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。