CHO细胞高效表达载体的优化
哺乳动物细胞蛋白表达FAQ
哺乳动物细胞蛋白表达FAQ1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。
2、CHO细胞与293细胞有什么区别？答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。
该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，（2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，（3）能够表达与人相似的翻译后修饰。
此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。
然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。
HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。
3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什么？答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1),该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。
该系统比常规的293F细胞表达量要高。
4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进行优化密码子。
蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。
(完整版)基于CHO细胞的单抗生产2
细胞库的相关法规要求
细胞库的检定
细胞库检定-CHO细胞
检测项目
细胞鉴别 细菌、真菌检查
MCP
+ +
WCP
+ +
分歧杆菌检查
+
+
支原体检查
(+)
(+)
细胞形态观察及血吸附试验
+
+
内 体外不同细胞接种培养法
+
+
、 动物和鸡胚体内接种法
+
-
源 病
逆转录病毒检查
+
-
毒 种属特异性病毒检查（鼠源）
(+)
荧光强度值能反映细胞
目标的相对表达水平
筛选方法
➢ ClonePix
Semi solid media
筛选方法
➢ Limiting dilution
有限稀释法(limiting dilution cloning, LDC)是一种通过梯度稀释以获得单 克隆的方法。 它的应用范围广, 对于大多数细胞类型, 如杂交瘤细胞、 CHO细胞及干细胞等都有较好的克隆分离效果。 LDC的操作过程大致 分为接种(铺板)、 筛选和扩增。 接种的细胞液经过逐级稀释后加到96 孔板中, 每个孔所含的细胞个数理论上不大于1
载体的一般性构成
1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻
研究高效蛋白质表达的技术和方法
研究高效蛋白质表达的技术和方法蛋白质是生物体内功能最为重要的分子之一，控制着细胞的生理过程。
研究蛋白质表达的技术和方法，对于深入了解蛋白质功能以及相关疾病治疗具有重要意义。
本文将介绍几种高效蛋白质表达的常用技术和方法。
一、刺激蛋白质表达的条件在进行蛋白质表达之前，首先需要确定适当的表达条件。
刺激蛋白质表达最常用的方法之一是通过诱导表达来增加蛋白质的合成量。
常用的诱导剂包括 IPTG、甘油和丙酮酸等。
此外，还可以根据表达蛋白的特性来选择合适的表达宿主和培养条件。
二、重组蛋白质表达系统重组蛋白质表达系统是一种常见的高效表达蛋白质的方法。
目前广泛应用的系统包括大肠杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
1. 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是最常用的蛋白质表达系统之一。
其优点在于操作简便、蛋白质产量高、成本低等。
大肠杆菌表达系统可以利用原核细胞内丰富的蛋白质合成机器进行表达，常见的载体系统包括pET、pGEX等。
2. 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统利用昆虫细胞进行外源蛋白质的表达。
此系统适合表达复杂、大型蛋白质，且具有较高的蛋白质折叠和翻译后修饰能力。
常用的昆虫细胞包括sf9和S2等。
3. 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是表达重组蛋白质的黄金标准。
相比于其他表达系统，哺乳动物细胞能够正确地翻译和修饰蛋白质。
常见的哺乳动物细胞包括CHO、HEK293等。
三、蛋白质表达的改进方法除了选择适当的表达系统外，还可以通过一些改进方法来提高蛋白质表达的效率和产量。
1. 信号肽优化信号肽是控制蛋白质合成和定位的重要序列。
通过对信号肽序列的优化，可以提高目标蛋白质的合成量和稳定性。
2. 确定适当的宿主菌株不同的大肠杆菌宿主菌株对蛋白质表达效果有差异。
在进行蛋白质表达之前，选择合适的宿主菌株能够提高表达效率。
3. 调节表达体系中其他环境因素除了上述方法外，还可以通过调节表达体系中其他环境因素，如温度、基因拷贝数、培养基组成等来提高蛋白质表达效率和产量。
CHO细胞表达系统研究新进展
CHO细胞表达系统研究新进展作者：申烨华， 耿信笃， Shen Yehua， Geng Xingdu作者单位：西北大学现代分离科学研究所,陕西省现代分离科学重点实验室,西安,710069刊名：生物工程进展英文刊名：PROGRESS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2000,20(4)被引用次数：27次1.Sunderji R查看详情[外文期刊] 1997(01)2.Florian M查看详情 19903.Werner R G查看详情 1993(0Ⅱ)4.张力查看详情 1991(05)5.Gross G查看详情[外文期刊] 19956.Cockett M I查看详情[外文期刊] 19907.丁锡申查看详情 1998(03)8.沈孝查看详情 1991(04)9.Bebbington C R查看详情[外文期刊] 199210.刘文军查看详情 1997(02)11.Bebhington C R查看详情 198912.Kelbems R K查看详情[外文期刊] 199113.Chalfie M查看详情 199414.Bronstein I查看详情[外文期刊] 199415.Chireux M查看详情[外文期刊] 199416.Rotondaro U High-Level Expression of a cDNA for Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor in Chinese Hamster Ovary Cells Effect of 3'-Noncoding Sequences[外文期刊] 1997(3)17.Conradt H查看详情 1989(29)18.陈峰查看详情 1998(01)19.曹勇查看详情 1998(01)20.龙建银查看详情 1997(02)21.Kirscboff S查看详情[外文期刊] 199522.Trudy H AN EXPRESSION VECTOR ENCODING A LACZ REPORTER GENE FACILITATES IDENTIFICATION OF STABLE, HIGH-PRODUCING CHO CELL CLONES[外文期刊] 1997(2)23.太光平查看详情 1998(09)24.Chen C Y A查看详情[外文期刊] 199525.Southard J N查看详情[外文期刊] 199526.Haas J查看详情 199627.Murphy C I查看详情[外文期刊] 199328.Kozak M查看详情 198729.Petitolerc D查看详情[外文期刊] 199530.陈度胜查看详情 1993(03)31.陈度胜查看详情 1992(02)32.Mizushimas查看详情[外文期刊] 1990(17)33.Andre Lieber查看详情[外文期刊] 199334.陈峰查看详情 1998(01)35.刘文军查看详情[期刊论文]-病毒学报 1997(02)36.Christianc查看详情[外文期刊] 199437.Keen Michael J查看详情[外文期刊] 1995(03)38.Munzert Eberhard查看详情[外文期刊] 1997(04)39.Gu Xuejun查看详情[外文期刊] 1997(04)40.戴燕查看详情 1998(03)41.Anim Cell Technol Basic Appl Aspects 199542.李风知查看详情 1993(02)43.Chang H CODON OPTIMIZATION FOR HIGH-LEVEL EXPRESSION OF HUMAN ERYTHROPOIETIN (EPO) IN MAMMALIAN CELLS[外文期刊] 1997(1/2)44.查看详情 199745.陈坚查看详情 1997(06)1.黄志斌.党建章重组人干扰素β表达体系及其适应证的研究进展[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2011(1)2.朱蓉.杜洪桥.谭洪兴.徐葛林.严家新CHO宿主细胞DNA残留量检测方法的建立[期刊论文]-中国生物制品学杂志2010(11)3.胡丽玲.李晓霞.张镜宇.王宝利BMP2与BMP7嵌合表达产物可诱导成骨细胞分化[期刊论文]-天津医药 2009(10)4.张俊河.张艳芳.王芳.杨献军.王天云转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用[期刊论文]-安徽农业科学 2009(18)5.时成波.徐军.王堃.贾重来.徐冬冬.盛军高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2009(12)6.唐静.高闻达.张青.张大为.陈洋.何波.刘全胜人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO/DG44细胞中的稳定表达[期刊论文]-生物工程学报 2009(1)7.唐量.胡柏平.熊正英.张英起Myostatin基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达[期刊论文]-体育科学2008(12)8.昝玉玺.王天云.张俊河.王俐人β-干扰素核基质附着区在CHO细胞中对转基因表达的调控[期刊论文]-中国组织工程研究与临床康复 2008(29)9.余阗哺乳动物细胞适应无血清培养的改造[期刊论文]-科技资讯 2007(22)10.郑立恒.李恒.宋桂芹.王琛琛.刘全胜CHO细胞无血清培养研究[期刊论文]-四川生理科学杂志 2007(1)11.张勇重组乙型肝炎疫苗(中国仓鼠卵巢细胞)临床效果综述[期刊论文]-中国计划免疫 2006(4)12.郑立恒.魏会平.许松梅.孙伟华.李保国.胡火珍.刘全胜增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究[期刊论文]-河北北方学院学报（医学版） 2006(1)13.史艳秋.陈畅.顾黎.邹思湘.宋静.王鹏重组人β干扰素在DHFR--CHO细胞中的高效表达[期刊论文]-中国生化药物杂志 2006(3)14.刘家华蛋白折叠液相色谱法中包涵体的碱溶法[学位论文]硕士 200615.王建武.陈秀萍.严正杰.丁家桐山羊FSH真核表达载体pVITRO-FSHαβ构建及在CHO细胞内稳定表达[期刊论文]-畜牧兽医学报 2005(11)16.陈振海.范学政.夏春.王琴.宋立.王在时.宁宜宝猪瘟病毒EO基因在CHO细胞中的表达[期刊论文]-中国预防兽医学报 2005(6)17.许凌峰CHO-dhfr<'->细胞改造的研究[学位论文]博士 200518.吴季南重组CHO细胞乙肝疫苗生产中工艺改进的实验研究[学位论文]硕士 200519.孔双泉.时成波.单连慧.张连忠.李洋.杨亦代.盛军一种新型HBsAg真核表达载体的构建[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2004(4)20.谢秋玲.陈小佳.戴云.汪炬.洪岸.林剑中国仓鼠卵巢细胞表达系统在疫苗研制中的应用[期刊论文]-中国公共卫生 2004(7)21.李萍.蒋琳.黄思扬.杨军.李薇.沈心亮中华仓鼠卵巢(CHO)工程细胞无血清培养的研究[期刊论文]-微生物学免疫学进展 2004(4)22.孔双泉重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[学位论文]硕士 200423.单连慧重组CHO细胞高效表达乙肝表面抗原的研究[学位论文]硕士 200424.王海波.申烨华.秦芳玲.刘江峰.耿信笃.张智清.侯云德大肠杆菌生产重组人干扰素-γ培养基的研究[期刊论文]-西北大学学报(自然科学版) 2003(2)25.吴丹.仇华吉.童光志几种表达系统的比较[期刊论文]-生物技术通报 2002(2)26.陈晓穗.王欲晓.朱迎春.张海荣.王琰抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达的影响因素探讨[期刊论文]-细胞与分子免疫学杂志 2001(6)27.陈晓穗.王欲晓.朱迎春.王琰抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达影响因素的研究[期刊论文]-海军总医院学报2001(2)28.黄志斌.党建章重组人干扰素β表达体系及其适应证的研究进展[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2011(1)本文链接：/Periodical_swgcjz200004005.aspx。
cho细胞发酵工艺
cho细胞发酵工艺
CHO细胞发酵工艺是一种利用CHO细胞（哺乳动物细胞的一种）进行发酵生产的工艺。
CHO细胞是常用的细胞系，因其
在研究和生产中的安全性、稳定性和高表达能力等方面具有优势。
CHO细胞发酵工艺通常包括以下步骤：
1. 细胞培养基的准备：CHO细胞需要合适的培养基来提供营
养物质和维持适宜的生长环境。
常用的培养基成分包括碳源、氮源、矿物质和生长因子等。
2. 细胞扩增：将CHO细胞接种到含有培养基的培养皿或生物
反应器中，通过适宜的培养条件（比如温度、pH值和氧气供
应等）来促进细胞生长和扩增。
3. 细胞适应性培养：将CHO细胞适应到特定的培养条件中，
以增加其对生产目标物质的产量和稳定性。
这可能需要逐步增加目标物质的浓度，逐渐适应细胞对该物质的耐受性。
4. 目标物质的表达：在细胞扩增和适应性培养的基础上，加入合适的基因表达载体或质粒，使CHO细胞表达目标物质（如
药物、酶或蛋白质等）。
5. 发酵过程控制：控制培养条件以实现最佳的生产效率和产量。
这包括控制温度、pH、氧气供应、培养基成分和产物积累等
参数。
6. 采收和纯化：当目标物质达到一定的产量后，将培养基中的细胞和目标物质分离，并对目标物质进行纯化和提纯，以获得高纯度的产品。
CHO细胞发酵工艺在制药和生物制剂领域应用广泛。
它可以用于大规模生产药物、疫苗、抗体和其他重要生物制剂，具有较高的产量和质量控制能力。
蛋白表达细胞株构建
蛋白表达细胞株构建
蛋白表达细胞株构建是一种将目标蛋白质基因转移到细胞中，使细胞能够表达目标蛋白的方法。
构建蛋白表达细胞株的步骤通常包括以下几个方面：
1. 选择合适的宿主细胞株：根据目标蛋白的特性和需求，选择合适的宿主细胞株。
常见的宿主细胞株包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、昆虫细胞（Sf9、Sf21）和哺乳动物细胞（HEK293、CHO）等。
2. 克隆目标基因：利用分子生物学方法，将目标蛋白质基因插入适当的表达载体中。
表达载体通常包括启动子、选择性标记和其他调控元件，以促进目标基因的高效表达和筛选。
3. 转染宿主细胞：将克隆好的表达载体导入到宿主细胞中，一般通过化学转染、电穿孔、病毒转染等方法进行。
转染后，经过一定时间的培养和筛选，选择表达目标基因的细胞株。
4. 高效表达：为了提高目标蛋白的表达水平，可以调节培养条件、优化表达载体和引入辅助因子等策略，以获得高产量的目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白：根据目标蛋白的特性，选择合适的蛋白纯化策略，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等技术，对表达的细胞株进行蛋白纯化和纯化。
需要注意的是，蛋白表达细胞株构建是一个复杂的过程，需要根据实际实验需求和目标蛋白的特性进行优化和改进。
cho细胞株构建流程
cho细胞株构建流程
CHO细胞株构建是一种用于大规模生产重组蛋白的技术，其
构建流程大致包括以下步骤：
1. 购买或制备宿主细胞：选择具有良好生长性能和高重组蛋白表达能力的CHO（Chinese hamster ovary）细胞的宿主细胞。
2. 选择筛选标记物：根据需要选择适当的筛选标记物，在细胞中引入相应的抗生素或抗代谢毒物抗性基因。
3. DNA构建：通过基因工程技术将目标基因插入适当的表达
载体中，包括启动子、信号序列和选择标记物等。
4. 转染：将重组蛋白表达载体导入CHO细胞中，使用电穿孔、化学转染或病毒介导等方法将表达载体导入细胞。
5. 选择表达细胞：通过培养基中添加适当的抗生素或抗代谢毒物，在一定浓度下筛选表达载体成功转入的细胞。
6. 单克隆分离：从表达载体成功转入的细胞中挑选出单个表达细胞。
7. 表达与筛选：培养单克隆细胞群，并通过适当的培养基组合、刺激剂添加等方法促进目标基因表达，最终选择表达水平较高的细胞株。
8. 扩增培养：将经过表达和筛选的细胞逐步扩增，以获得大量
的细胞用于后续的蛋白表达和生产。
整个CHO细胞株构建流程涉及到细胞培养、细胞转染、筛选、表达与筛选、单克隆分离等多个步骤，需要精确操作和耐心等待，最终获得高效的CHO细胞株用于大规模重组蛋白的生产。
Tumstatin—EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立
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ｔ ｓｔ —Ｇ Ｐ的表达 ， ｕ ｔｉ Ｅ Ｆ ｍ ａｎ 用倒置荧光 显微 镜观 察绿 色荧 光 蛋 白的表达 。结果 重组 真 核表 达载 体 正确 构建 并在
Ｃ Ｏ细胞获得稳定表达 ， ｍ ｔ ｉ．Ｇ Ｐ基 因整合入细胞基 因组 Ｄ Ａ， Ｈ ｔ ｓｔ Ｅ Ｆ ｕ ａｎ Ｎ 培养液上清有 融合蛋 白 ｔｍｓ ｔ —Ｇ Ｐ的分 ｕ ｔｉ Ｅ Ｆ ａｎ 泌， 绿色荧光蛋 白的表达高达 ９ ％ 以上。结论 ５
Ｅ Ｆ Ｇ Ｐ的 细 胞 系 。
成功 构建 了质 粒 ＰＲ Ｓ ｅ３Ｓ ＬＥ Ｆ 获 得稳 定表 达 ｔｍｓ ｔ — ＩＥ ｎｏ 一Ｔ — Ｇ Ｐ， ｕ ｔｉ ａｎ