四环素类药物检测(高效液相色谱法).

表3
分离七种四环素类药物的液相色谱流动相的洗脱体积
时间/min
甲醇/%
乙腈/%
10mmom/L 三氟乙酸/%
0
1
4
95
5
6
24
70
9
7
28
65
12
0
35
65
15
0
35
65
测定步骤
C）流速：1.5mL/min。 D）柱温：30℃。 E）进样量：100uL。 F）检测波长：350mm。
测定步骤
高效液相色谱测定： 根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。 标准工作溶液和样液中四环素类兽药残留的响应值均应在仪器的检测线性范围内。 对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，在上述色谱条件下，二甲胺四环素、 土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素的参考保留时 间分别约为6.3min、7.5min、7.9min、8.7min、9.8min、10.4min、10.8min标准
测定步骤
C）定量离子、定性离子及子离子丰度比 每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子 离子，而且同一检测批次对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离 子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表5.22 规定的范围。
表2
定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度
样品制备与贮存
制样过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 1. 动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品 从所取全部样品中取出约500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净 容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻存放。
2. 牛奶样品
从所取全部样品中取出约500g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并 标明标记，于-18℃以下冷冻存放。
2. 乙腈：高效液相色谱纯。
3. 乙酸乙酯。 4. 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。 5. 三氟乙酸。 6. 柠檬酸（C5H8O7·H2O）。
试剂和材料
7. 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）
8. 柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸用水溶解，定容至1000ml。
2.0kPa以下减压抽干5min，最后用10ml甲醇+乙酸乙酯洗脱。将洗脱液吹 氮浓缩至干（温度低于40℃），用1.0ml（液相色谱-质谱/质谱法）或
0.5ml（高效液相色谱法）甲醇+三氟乙酸水溶液溶解残留渣，过0.45um
滤膜，待测定。
测定步骤
3．测定 （1）液相色谱-质谱/质谱法 液相色谱条件： A）色谱柱：incrtsil C8-3，5um，150mm×2.1mm（内径），或相当者。 B）流动相：甲醇+10mmol/L三氟乙酸，梯度洗脱见表1。
冰水浴超声10min，转移至50ml聚丙烯离心管中，冷却至0℃-4℃，
500r/min离心10min（温度低于15℃），用快速滤纸过滤，待净化。
测定步骤
2. 净化 准确吸取10ml提取液（相当于1g样品）以1滴/l水和5ml甲醇+水淋洗，弃去全部流出液。
胺四乙酸二钠放入 1625mL Mcllvaine 缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。 12. 甲醇+水（1+19）：量取5ml甲醇与95ml水混合。
13. 甲醇+乙酸乙酯（1+9）：量取10ml甲醇与90ml乙酸乙酯混合。
14. Oasis HLB固相萃取柱：60mg，3ml，或相当者。使用前分别用
5ml甲醇和5ml水预处理保持柱体湿润。
试剂和材料
15. 三 氟 乙 酸 水 溶 液 （ 10mmol/L ） ： 准 确 吸 取 0.765ml 三 辅 乙 酸 于
1000ml容量瓶中，用水溶解定容至刻度。
16. 甲醇+三氟乙酸水溶液（1+19）：量取50ml甲醇与950ml三氟乙酸水溶 液混合。 17. 标准物质：二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉 素、甲烯土霉素、强力霉素、差向土霉素、差向四环素、差向金霉素标准
品。纯度皆大于等于95%。
试剂和材料
18. 标准储备液：准确称取按其纯度折算为100%质量的二甲胺四环素、 土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素、差 向土霉素、差向四环素和差向金霉素各10.0mg，分别用甲醇溶解并定容 至100ml，浓度相当于100mg/L ，储备液在 -18℃以下贮存于棕色瓶中， 可稳定12个月以上。 19. 混合标准工作溶液：根据需要，用甲醇+三氟乙酸水溶液将标准储 备溶液配制为适当浓度的混合标准工作溶液。混合标准工作溶液应使用 前配制。
测定步骤
1. 提取 （1）动物肝脏、肾脏、肌肉组织、水产品 称取均质试样5g（精确到0.01g），置于50ml聚丙烯离心管中，分别用 约20ml、20ml、10ml 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液冰水浴超声提
取三次，每次漩涡混合1min，超声提取10min，3000r/min离心5min，合
并上清液（注意控制总提取液的体积不超过50mL），并定容至50ml，混 匀，5000r/min离心10min，用快速滤纸过滤，待净化。
测定步骤
1. 提取 （2）牛奶 称取混匀试样5g（精确到0.01g），置于50ml比色管中，用 0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲溶液溶解并定容至50ml，漩涡混合1min，
表1 分离10种四环素类药物的液相色谱洗脱梯度
时间/min 0
甲醇/% 5.0
10 mmol/L 三氟乙酸/% 98.0
5.0
10.0 12.0 17.5 18.0 25.0
30.0
33.5 65.0 65.0 5.0 5.0
70.0
66.5 35.0 35.0 95.0 95.0
测定步骤
3．测定
V——定容体积，单位为毫升（mL）。 AS——标准液中待测组分的峰面积。 M——最终样液所代表的样品质量，单位为克（g）。
原理
试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液 （pH-4.0±0.05）提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化， 高效液相色谱仪或液相色谱喷雾质谱仪测定，外标峰面积法定量。
试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 1. 甲醇：高效液相色谱纯。
溶液的色谱图参见GBT 21317-2007。
测定步骤
（六）空白实验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行 （七）结果计算与表述 采用外表法定量，按下式计算四环素类兽药残留量。
测定步骤
式中：
X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（μ g/kg）。
AX——测定液中待测组分的峰面积。
CS——标准溶液中待测组分的含量，单位为微克每升（μ g /L）。
15.7min、甲烯土霉素16.6min、强力霉素16.7min，标准溶液的色谱图参见GBT
21317-2007。
测定步骤
（2）高效液相色谱法 液相色谱条件： A）色谱柱：Incrtsil C8-3，5um，250mm×4.6mm（内径），或相当者。 B）流动相：甲醇+乙腈+10mmol/L三氟乙酸，洗脱梯度见表5.23（柱平衡时间 5min）。
C)流速：300uL/Min。 D）柱温：30℃。 E) 进样量：30uL。 质谱条件： 离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ESI+）；质谱扫描方式：多反应 监测（MRM）；分辨率；单位分辨率。
测定步骤
定性测定： A）保留时间 待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在 ±2.5%之内。 B) 信噪比：待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等 于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10 （S/N≥10）。
仪器和设备
1．液相色谱串联四级杆质谱仪或相当者，喷电雾离子源。
2．高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器或紫外检测器。
3．分析天平：感量0.1mg，0.01g。 4．漩涡混合器。 5. 低温离心机：最高转速5000r/min，控温范围为-40℃至室温。
仪器和设备
6．吹氮浓缩仪。 7. 固相萃取真空装置。 8. pH计：测量精度±0.02。 9. 组织捣碎机。 10. 超声提取仪。
9. 磷酸氢二钠溶液：0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠用水溶解，定容
至1000ml。
10. Mcllvaine 缓冲溶液：将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节
pH=4.0±0.05。
试剂和材料
11. Na2EDTA- Mcllvaine 缓冲溶液： 0.1mol/L 。称取 60.5g 乙二
四环素类药物检测方法
高效液相色谱法
兽药残留检测
使用范围
本方法适用于动物肌肉、内脏组织、水产品、牛奶等动物源性食品
中二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉
素、强力霉素7种四环素类兽药残留量的高效液相色谱测定和二甲胺四 环素、差向土霉素、土霉素、差向四环素、四环素、去甲基金霉素、差 向金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素10种四环素类药物残留量的 液相色谱-质谱/质谱测定。
＞50%
＞20%-50%
＞10%-20%
≤10%
允许的相对偏差
±20%
±25%
±30%
±50%
测定步骤
定量测定： 根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。 标准工作溶液和样液中四环素类兽药残留的响应值均应在仪器的检测线性范围内。 对标准工作溶液和样液等体积参插进行测定。各种四环素类药物的参考保留时间 如下：二甲胺四环素9.6min、差向土霉素11.6min、土霉素11.8min、差向四环素 10.9min、四环素11.9min、去甲基金霉素14.6min、差向金霉素13.8min、金霉素