合成细胞培养基相关知识
细胞培养各种培养基简介
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。
一、基础培养基绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。
最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。
而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。
MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。
Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。
选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。
例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。
F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。
在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。
对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。
MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。
这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。
原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。
实际操作中并非如此简单。
显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。
细胞培养基简介
依据实验目的选择培养基
增殖实验
选择能够支持细胞快速增殖的培养基，以便在短时间 内获得大量细胞。
诱导分化实验
选择能够诱导细胞分化的培养基，以便观察细胞分化 过程和分化后的表型特征。
基因转染实验
选择能够支持基因转染的培养基，以便将外源基因导 入细胞并观察其对细胞表型的影响。
优化培养基配方
调整营养成分
较高。
无血清培养基
总结词
无血清培养基是指在培养基中不添加任何动物来源的血清，完全由化学成分合成的培养基。
详细描述
无血清培养基不含动物来源的血清，而是通过添加多种化学成分来模拟血清的功能，如添加蛋白质、生长因子等 。无血清培养基适用于生产疫苗、单克隆抗体等生物制品，因为其成分明确、质量控制方便，且能够避免血清批 次差异对细胞培养的影响。
再生医学
细胞培养基在再生医学领域也有广泛应用，如组织工程、器官再生等 。
发展趋势
1 2 3
新型细胞培养基的开发
随着生物技术的不断发展，对新型细胞培养基的 需求越来越高，如无血清培养基、个性化培养基 等。
细胞培养基的个性化定制
根据不同细胞类型和实验需求，细胞培养基需要 进行个性化定制，以满足特定实验条件和生产需 求。
细胞培养基市场的主要参与者包括生 物技术公司、科研机构和制药企业等 。
细胞培养基市场主要集中在美国、欧 洲和亚太地区，其中亚太地区增长最 快。
应用领域
生物制药
细胞培养基是生物制药生产过程中必不可少的原料之一，用于大规 模培养细胞，生产重组蛋白、单克隆抗体等生物药物。
科学研究
细胞培养基广泛应用于生命科学、医学、药学和农业等领域的基础 研究和应用研究，如肿瘤研究、免疫学研究、干细胞研究等。
DMEM等细胞培养基的基本知识
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。
一、基础培养基绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。
最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。
而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。
MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。
Dulbecco`s 改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。
选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。
例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。
F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。
在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。
对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。
MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。
这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。
原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。
实际操作中并非如此简单。
显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。
第二章 培养基
H H H N S O O N
CH3 CH 3 COOH
14
• 青霉素合成中用玉米浆，因玉米浆中含有 苯乙胺，其被优先结合到青霉素分子中， 提高了青霉素G的产量。 • 另有半胱氨酸及缬氨酸
H H H N S O O N
CH3 CH 3 COOH
15
第二节
培养基的配制原则
一.营养物质应满足微生物的需要 不同营养类型的微生物对营养的需求差 异很大，所以，应根据所培养菌种对各营 养要素的不同要求进行配制。如自养微生 物的培养基成分是无机的，而异养型微生 物的培养基成分必须含有机物。 针对四大类微生物，一般可以采用现成 配方的培养基。如细菌采用肉汤蛋白胨培 养基、放线菌采用高氏1号合成培养基、酵 母采用麦芽汁培养基及霉菌采用查氏合成 培养基。
第二章 培养基
1
第一节 培养基的成分及来源
• 1．定义：培养基是人工配制的供微生物或 动植物细胞生长，繁殖，代谢和合成人们 所需产物的营养物质和原料，同时，培养 基也为微生物等提供除营养外的其它生长 所必须的环境条件。 • 2．培养基要求 （1）都必须含有作为合成细胞组成的原料 （2）满足一般生化反应的基本条件，如C、 N源，无机盐、生长因素
9
（2）无机氮源
• • • • • 1）种类：铵盐、硝酸盐和氨水等。 无机氮源比有机氮源吸收利用快 无机氮源称为迅速利用N源 有机氮源称为缓慢利用N源 生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）的能 形成酸性物质无机氮源称为生理酸性物质
• 生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）的能 形成碱性生物的无机氮源称为生理碱性物质
16
二.营养物的浓度及配比应恰当 营养物的浓度太低，则不能满足 微生物生长的需要，浓度太高，又会 抑制微生物的生长。如糖和盐都是良 好的营养物质，但是，浓度升高，则 有抑菌作用。
人教版高二生物选修三知识点总结：专题二细胞工程
选修3《现代生物科技专题》知识点总结专题2 细胞工程（一）植物细胞工程1.植物组织培养技术（1）原理：植物细胞的全能性全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞脱分化再分化发育（2）过程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织胚状体植物体常用的植物激素生长素和细胞分裂素。
（3）用途：微型繁殖、作物脱毒（选材应该选择茎尖组织）、制造人工种子、单倍体育种（最大的优点是明显缩短育种年限，得到的全为纯种）、筛选突变体、细胞产物的工厂化生产。
（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
2.植物体细胞杂交技术（1）原理：细胞膜的流动性、植物细胞的全能性（2）过程：去壁的方法：酶解法；诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电激等。
化学法是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。
（4）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
（2）原理：细胞增殖（3）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
（4）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
（5）动物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。
此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
通常需加入血清、血浆等天然成分。
培养基的成分与合成。
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理
B、使用时注意盐的形式（pH的变化） 例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
不加
加 K2HPO4 加 KH2PO4
pH 4.25 5.45 4.62
酶活 120分钟 30分钟 75分钟
五、生长因子、前体和产物促进剂
二、发酵生产中的培养基类型
工业发酵中培养基往往是依据生产流程和 作用分为： ?斜面培养基 ?种子培养基 ?发酵培养基 ?摇瓶培养基
?特点： 1.富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有 利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。
2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源 和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少 形成孢子。 3.斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要 的生长因子和微量元素。
不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许 多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
例：谷氨酸发酵 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素
例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐
斜面培养基
?作用：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包 括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线 菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基 主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养 物质。
作用：
固体培养基在菌种的分离、 保藏、菌落特征的观察、活 菌计数和鉴定菌种方面是不 可缺少的。
在制曲、酶制剂、柠檬酸 等生产中，用来培养霉菌等 的固体种子和发酵培养基是 由麸皮等农作物加无机元素 等制成的。
细胞培养基大全
细胞培养基⼤全⼀、细胞培养基的概念和原理细胞培养基是⼈⼯模拟细胞在体内⽣长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞⽣长增殖的物质基础。
培养液或培养基的含义⼏乎相同，英⽂都是medium。
当它是粉剂时，倾向性地称为培养基，⽽将粉剂配成液体后，多称为培养液。
培养液中常常补加⾎清、抗⽣素等成分。
培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和⽆⾎清细胞培养基等。
天然细胞培养基是⼈们早期采⽤的细胞培养基，直接取⾃于动物组织提取液或体液，如⾎浆凝块、⾎清、淋巴液、胚胎浸出液等。
营养价值⾼，但成分复杂，差异⼤、不稳定，来源也受到限制。
⽔解乳蛋⽩和胶原是两种较好的天然培养基，富含氨基酸。
⾎清是天然培养基中最有效和最常⽤的培养基，但其组成成分复杂，其中⼀些成分与功能不明确。
⾎清的来源有胎⽜⾎清、⼩⽜或成⽜⾎清、马⾎清、鸡⾎清、⽺⾎清及⼈⾎清，最⼴泛应⽤的为胎⽜⾎清和⼩⽜⾎清。
合成细胞培养基是⽤化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维⽣素、⽆机盐类等。
⾃1950 年199 细胞培养基问世以来，合成细胞培养基发展⾄今已有⼏⼗种，除了沿⽤半个世纪的基础合成细胞培养基之外，近年来还出现了营养成分更加丰富的低⾎清细胞培养基。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常⽤基础细胞培养基有6～7 种，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。
由于天然培养基的⼀些营养成分不能被合成细胞培养基完全代替，因此⼀般需在合成细胞培养基中添加5％～10％的⼩⽜⾎清。
⼩⽜⾎清的加⼊对细胞培养⾮常有效，但⼩⽜⾎清的成分复杂，这对培养产物的分离纯化和检测会带来⼀定的不便，为减少⼩⽜⾎清的影响，开发了营养成分更加丰富的低⾎清细胞培养基，可以将⼩⽜⾎清的使⽤量降低到1～3％。
⽆⾎清细胞培养基（serum free medium， SFM）是指在使⽤中⽆需添加⾎清的细胞培养基，且其组成成分不含有任何动物组分。
高中生物第章细胞工程.1动物细胞培养学案选择性3
动物细胞培养必备知识·素养奠基一、动物细胞培养概念从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
二、动物细胞培养的条件1。
营养条件:(1)合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成。
（2)天然成分：血清等.（3）一般使用液体培养基,即培养液。
2。
无菌、无毒的环境：(1）培养液和培养用具灭菌处理。
(2）无菌环境下操作.（3）培养液定期更换的目的：清除代谢物,防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
3。
温度、pH和渗透压:(1)适宜的温度：哺乳动物多以36。
5±0。
5℃为宜。
(2）适宜的pH:多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
(3)适宜的渗透压。
动物细胞培养能否体现动物体细胞的全能性？说明你的理由。
提示:不能。
动物细胞培养只是细胞的增殖，没有体现细胞的全能性。
4.气体环境：95％空气和5%CO2。
（1)O2作用：细胞代谢所必需的。
(2）CO2的主要作用：维持培养液的pH。
三、动物细胞培养的过程填一填：基于动物细胞培养的过程，完成下面的问题:（1)过程①处理方法有:机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法.(2）过程②为原代培养,培养的动物细胞有两类:①悬浮在培养液中生长增殖;②贴附于某些基质表面生长增殖。
(3）进行过程③时,悬浮培养的细胞直接用离心法收集;贴壁细胞需要使用胰蛋白酶等处理，然后用离心法收集.（4)过程③为传代培养，进行过程③的原因主要有:细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏和接触抑制等。
四、干细胞培养及其应用1。
干细胞分布：早期胚胎、骨髓和脐带等。
2.种类：胚胎干细胞和成体干细胞。
3.判一判：基于干细胞的类型和应用,判断下列说法的正误。
(1)胚胎干细胞和成体干细胞都具有形成机体的所有组织和器官,甚至个体的潜能. (×)提示:成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。
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合成细胞培养基相关知识
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。
它有一定的配方，是一种理想的培养基。
目前合
成培养基多达10多余种，有的培养基仍在不断进行改良。
早期组织培
养是利用天然培养基，目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，
从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在
不断发展。
合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。
一、基本组分
基本培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。
●无机盐：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。
对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。
● 氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精
氨酸、胱氨酸(L型)。
它们都是细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能
由其他氨基酸或糖类转化合成。
除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamin e)。
谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种
氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。
细胞需要谷氨酰胺
合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。
在
配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。
值得注意的是：谷氨
酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独
配制，置-20℃ 冰箱中保存，用前加入培养液中。
●维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成
酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重大影响。
脂溶性维生素(A、D、E、K)常从血清中得到补充。
水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛
酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和B12。
维生素C也是不可缺少的，对具
有合成胶原能力的细胞更为重要。
●碳水化合物：是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的
成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖和丙酮酸钠等。
体外培养动物
细胞时，几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。
●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的产物。
研究表明，体外培养条件下95％的葡萄糖转变为乳酸，这降低了营养
物质的代谢效率，降低培养基pH值，增加渗透压。
在氧气供给不足的
情况下，NADH转运系统苹果酸－天冬氨酸穿梭系统活性低而不能将糖
酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+，细胞只得以降低能量需求的方式
如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生的丙酮酸与NADH反应生产乳酸和NAD+，从而保证了糖酵解的顺利进行。
另一个可能的解释是连接糖酵解与TCA
循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙
酮酸羧化酶活性低下，直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。
因此体外培
养条件下，葡萄糖主要经糖酵解降解，产生过量的乳酸。
减少乳酸生
产最常用的方法是限制培养基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量过低可
造成细胞营养供应不足，细胞生长抑制。
该方法需要对葡萄糖的消耗
与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达量等参数进行综合考虑
方可应用。
在目前常用的培养基中，葡萄糖和谷胺酰胺是体外培养动物细胞的主
要能源，其能量代谢通路与体内完全不同，表现为葡萄糖主要经糖酵
解途径为细胞提供能量，谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径，另一
小部分通过完全氧化为细胞供能。
因此，适当的调整细胞内的代谢途径，使之能促进细胞的快速生长和产物合成，同时减少代谢抑制物的
生成是行之有效的一种策略。
许多动物细胞如CHO、BHK和杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖和谷氨酰胺
的消耗利用很快。
然而对于细胞生长而言，二者的快速利用并非细胞
必需；相反相当一部分转化为代谢废物乳酸和氨，以及一些非必需氨
基酸如丙氨酸，脯氨酸。
其中，乳酸和氨是两种主要代谢废物，其积
累可影响细胞生长以及产品质量。
减少这两种代谢产物的积累，是大
规模细胞培养技术研究的重要方向。
氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺产生的。
限制培养基中谷氨酰胺的含量亦
是减少氨生成的常用方法。
● 除了以上与细胞生长有关的物质以外，培养基中一般还要加入酚红（当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于8.4呈红色），一种pH指示剂。
●在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)以及
氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。
有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和
辅酶A。
二、常用细胞培养基
(1).MEM细胞培养基系列
(2).DMEM细胞培养基系列）
(3)RPMI-1640细胞培养基系列
(4).199细胞培养基系列
(5).水解乳蛋白细胞培养基
(6)欧氏平衡盐）
(7)F-10,F-12细胞培养基系列
(8)其它类型细胞培养基
细胞培养基产品大全：
三、干粉培养基的配制
配制培养基要注意以下问题：
●认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO
3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如N aHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
● 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。
●配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。
● 所用器皿应严格消毒。
●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
●液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。
配制方法
●在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水。
●在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。
●水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。
●加NaHCO3到培养基中。
●用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
●通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3。
培养基在过滤前要保持密封。