测序原理

什么是测序？

确定一条DNA序列的碱基顺序

Sanger法——双脱氧链终止法

Fred Sanger

“双脱氧末端终止”的含义

PCR（聚合酶链式反应）

反应

测序原理

根据Sanger（双脱氧终止法）测序的原理：模板经过测序PCR反应后形成在3’末端带有荧光标记（早期用同位素标记）的相差1个碱基的不同长度的产物，再根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列。

早期手动测序原理flash secuencia.swf

目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳

单色荧光标记平板电泳同位素标记

平板电泳

A C G T A C G T

测序图谱

T A TT G C A T T G T C T G C A TT G T C T

普通PCR与测序PCR对比
扩增方式
指数扩增
线性扩增

酶
Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。Taq DNA聚合酶是热稳 定聚合酶热不稳定
Taq DNA聚合酶——无3‘→5’核酸外切酶活性 Tag酶的自动加尾——终止碱基A，TA克隆 PCR反应的放大效应——突变位点

TA克隆
pGEM® -T载体系统是克隆 PCR产物的方便系统。 pGEM® -T载体是通过 EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)载 体，并在3‘末端加入胸腺嘧啶 构建的。 pGEM ® -T载体 插入位点3'-T突出端可极大提 高PCR产物的连接效率，因为 3'-T突出端可以防止载体的自 身环化，并且为热稳定性聚合 酶产生的的PCR产物提供一个 匹配碱基。这些聚合酶常常以 模板不依赖模式在扩增产物的 3'端加上一个脱氧腺苷酸。 所以T-A克隆没有方向性。

引物
通用 引物

引物的设计原则
测序用引物要求较高：
1）长度在17～25个碱基左右 2）Tm温度应选择50℃～60℃左右，GC含量应选择 在45% ～60% 左右 3）避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构 4）保证引物和模板100%匹配，特别是3’端的几个碱 基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之 间 只能有一个结合位点，绝对避免错配。 5）不能用简并引物，随机引物

模板——样品类型
• 菌液样品J
菌液，平板，穿刺等
• 质粒样品Z • PCR样品
未纯化：过膜（G），切胶（Q）； 已纯化（Y）

菌液和质粒样品的来历
• 基因克隆（molecular cloning）
通过体外重组技术，将一目的DNA经切割、连接插入 适当载体，并导入适当受体细胞，扩增形成大量子代分 子的过程。
• 基因克隆的核心
体外重组（recombination） 将目的DNA插入一个载体的过程。

基因克隆过程示意图
③ ① ② ④
①从细胞中分 离出DNA ②限制酶截取 DNA片断 ③分离大肠杆 菌中的质粒 ④ DNA重组
⑤ ⑥
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因/ 使其表达

引导客户送菌液样品进行测序
• 自配试剂提取
各实验室间差别较大，对制备所得的质粒纯度影响较大 ，一般含有抑制测序反应的化学物质。
• 使用试剂盒提取
试剂盒种类繁多，国产试剂盒品质不一
• TE（含EDTA）
因此实验室在收到质粒样品的时候会对样品进行过膜纯 化，然而，目前市面上没有一种性价比均能接受且对抑 制剂完全有效的纯化方法，应当引导客户尽量送菌液样 品进行测序。

PCR产物的纯化
1、PCR未纯化产物组分
2个引物、dNTP、基因组模板、扩增酶、其他离子
2、纯化方法
• 过膜 条带单一 • 切胶 主带清晰，拖带不严重
PCR产物克隆测序（模板不纯、杂合、短 片段）

Thank you！

案例1•找不到测序所用引物序列•测序结果出现杂合、结合

问题解答

•找不到引物序列

Sanger法测序原理决定了在测序结果中是无法找到测序所用的引物序列的，原因是测序引物不带荧光信号，无法被测序仪收集并完成测序。

•结合问题

主要是模板与引物结合出现问题，或模板不纯，，或引物在模板上有两个或两个以上结合位点，建议老师设计内引物或克隆后进行测序。

•杂合问题

为老师自身序列问题，无法避免。建议老师克隆后再测序。

案例2

•GC含量高、结构、重复序列导致结果不可用

问题解答

•GC含量高、结构样品

在测序反应时变性困难，建议老师尝试我们的优化程序进行测序。

•重复序列

属样品本身问题，无法通过测序手段避免。

案例3

•老师使用自带引物测序总是无信号•老师使用通用引物测序找不到插入片段•老师测序结果出现非单克隆

问题解答

•自带引物无信号

样品为空载，自带引物在载体上没有结合位点，因此测序结果无信号。

自带引物不适合测序

•通用引物测序未找到插入片段

有些载体存在多克隆位点及多个通用引物，必须使用老师酶切位点的通用引物才能测序得到插入片段的序列；也可能样品本身为空载。

•非单克隆

老师在挑取单菌落的时候产生污染，造成测序峰图出现非单克隆情况。