国内酶法GSH生产技术
gst蛋白纯化原理
gst蛋白纯化原理GST蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理是利用谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）标签与谷胱甘肽的特异性结合来进行纯化。
GST标签可与谷胱甘肽通过二硫键共价亲和，然后通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。
具体步骤如下：1.构建GST标签融合表达载体：将GST基因的编码序列与目标蛋白的编码序列融合，构建GST-目标蛋白融合表达载体。
这样，在细胞中表达该融合蛋白时，GST标签会紧密结合在目标蛋白的C端或N 端。
2.转染和蛋白表达：将构建好的GST-目标蛋白融合表达载体转染到合适的宿主细胞（如大肠杆菌），使其产生大量的融合蛋白。
3.细胞裂解和融合蛋白的亲和层析：收获融合蛋白的细胞，通过细胞裂解等方法破坏细胞膜，释放融合蛋白。
然后，将溶解的细胞提取物加载到含有谷胱甘肽固定在琼脂糖（或其他载体）上的亲和层析柱中。
GST标签可以特异性地与琼脂糖上的谷胱甘肽结合。
4.洗脱：通过洗脱缓冲液来去除非特异性结合的蛋白质，保留GST-目标蛋白复合物。
洗脱通常使用还原剂（如谷胱甘肽）、低pH 或其他方式进行。
5.目标蛋白的解离：将GST标签从目标蛋白上解离，得到纯化的目标蛋白。
这可以通过特定的酶切位点（如蛋白酶TEV切割位点）和相应的酶进行酶切，使GST和目标蛋白分别释放。
6.纯化分析：对纯化的目标蛋白进行分析，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等方法，确认目标蛋白的纯度和完整性。
在进行GST蛋白纯化时，对于融合表达载体的设计和构建、宿主细胞的选择、裂解条件和亲和层析条件的优化等方面都需要合理考虑，以获得高质量的纯化目标蛋白。
国内谷胱甘肽研究进展
国内谷胱甘肽研究进展
张照明;张海涛;袁利明
【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2009(37)3
【摘要】谷胱甘肽(GSH)是一种重要的医药保健产品,在临床上用于肝脏保护、治愈肿瘤、解除氧中毒、抗衰老和治疗内分泌紊乱等疾病,效果明显无毒副作用,在医疗、保健品加工等领域有广泛的市场.介绍了国内GSH的研究和生产现状、产品用途和市场前景.
【总页数】3页(P55-57)
【作者】张照明;张海涛;袁利明
【作者单位】东营市源聚生物制品有限公司,山东,东营,257200;东营市科维生物技术有限公司,山东,东营,257091;东营市源聚生物制品有限公司,山东,东营,257200【正文语种】中文
【中图分类】TQ2
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谷胱甘肽还原酶检测说明书
谷胱甘肽还原酶检测说明书
谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）检测是一种用于测定谷胱甘肽还原酶活性的实验方法。
谷胱甘肽还原酶是一种关键的抗氧化酶，参与谷胱甘肽（glutathione，GSH）的再生过程，从而保护细胞免受氧化损伤。
以下是一种简化的谷胱甘肽还原酶检测说明：
1.实验原理：谷胱甘肽还原酶检测主要依赖于酶促
反应的光度测定。
在此反应中，谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）还原为还原型谷胱甘肽（GSH），同时将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADP+）。
反应过程中，NADPH的消耗可以通过其吸光度的变化来监测。
2.实验试剂：主要试剂包括缓冲液、还原型谷胱甘
肽、氧化型谷胱甘肽、NADPH、谷胱甘肽还原酶标准品等。
3.实验步骤：
a.样品处理：收集需要测定谷胱甘肽还原酶活
性的样品（如血清、组织或细胞提取物等），
并进行适当的处理和稀释。
b.反应体系建立：在96孔板中，分别加入缓冲
液、样品、GSSG和NADPH，然后添加谷胱
甘肽还原酶标准品。
c.光度测定：在340nm波长下，定时测定各孔
的吸光度变化，记录吸光度值。
d.计算结果：根据吸光度变化值，计算样品中
谷胱甘肽还原酶的活性。
4.注意事项：
a.在操作过程中，请遵循实验室安全规程，佩
戴必要的防护装备。
b.实验过程中，请保持试剂的纯净和稳定。
c.光度测定时，请确保仪器的准确性和稳定性。
谷胱甘肽过氧化物酶
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒
微量法100T/96S
测定意义：
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。
GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。
测定原理：
GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。
GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。
测定原理：GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、酶标仪、96孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配置：试剂一：液体120mL×1瓶，室温保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体10μL×1支，-20℃保存。
试剂四：液体200μL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
GSH-Px测定操作：1. 酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm。
2. 混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。
3. 混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一20 mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)试剂盒说明书
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）试剂盒说明书谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。
测定意义：GSHPx是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的重要酶之一、GSHPx不但能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的损害和加添机体抗辐射等本领。
测定原理：GSHPx催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征汲取峰，而NADP+没有；通过测定340nm光汲取减少速率来计算GSHPx活性。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调整移液器、酶标仪、96孔板和蒸馏水。
试剂构成和配置：试剂一：液体120mL×1瓶，室温保管。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保管。
试剂三：液体10μL×1支，20℃保管。
试剂四：液体200μL×1瓶，4℃保管。
粗酶液提取：1.组织：依照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5～10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：依照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500～1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波碎裂细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
GSHPx测定操作：1.酶标仪预热30min，调整波长到340nm。
2.混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。
谷胱甘肽 (2)
1、简介谷胱甘肽是一种三肽(L - γ- 谷氨酰- L - 半胱氨酰-甘氨酸) 化合物,它广泛分布于动物、植物、谷物和油料种子中,它在细胞中的功能之一就是抵御各种毒素和致癌剂。
有研究表明:谷胱甘肽在小肠中能被完全吸收,并且某些上皮细胞能利用外源谷胱甘肽来去毒,这说明膳食中的谷胱甘肽决定着人体中细胞受损伤的程度。
除作为抗毒剂外,谷胱甘肽还对一些巯基酶有激活作用,可作为保护酶和其他蛋白巯基的抗氧化剂,在生物氧化、氨基酸转运、保护血红蛋白等过程中起一定作用。
另外,谷胱甘肽还具有抑制衰老,预防糖尿病、消除疲劳等作用。
最近研究还发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病毒的作用。
因此,研究谷胱甘肽对人类的健康和生活具有重要的意义。
2、谷胱甘肽在自然界的分布谷胱甘肽在自然界中分布很广,主要存在于动物组织和血中,许多植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类等也含有,另外酵母中谷胱甘肽的含量也较高。
2 谷胱甘肽的特性及生理功能211 谷胱甘肽的特性谷胱甘肽分子量为307. 33 ,熔点189～193 ℃(分解) ,晶体是无色透明细长柱状(板状) ,等电点(PI) 为5. 93 ,成品见光易分解,易氧化,谷胱甘肽分子中有一特殊的δ- 肽键,即由谷氨酸的δ- COOH 与半胱氨酸的α- NH2 缩合而成,这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中α- COOH 和另一个氨基酸中α- NH2 失水缩合而成的肽键显然不同。
由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化,2 分子还原型谷胱甘肽(简称GSH) ,脱氢以二硫键( S S ) 相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG) ,所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类,在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。
2.2 谷胱甘肽的生理功能谷胱甘肽的生理功能主要表现在6 个方面:(1) 维持红细胞膜的完整性。
(2) 对于需要巯基的酶有保护与恢复活性的功能。
(3) 谷胱甘肽是多种酶的辅基与辅酶。
(4) 参与氨基酸的吸收及转运。
酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究
实验号
１ ２ ３ ４
表 ２ 正交实验结果
Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｄ 含量（％）
１
１
１
１
０．４３
１
２
２
２
１．６４
１
３
３
３
１．４５
２
１
２
３
２．０１
—１７—
发酵科技通讯
第 ３７ 卷
５
２
２
３
１
１．３８
６
２
３
１
２
１．０４
７
３
１
３
２
１．２５
８
３
２
２
３
１．８３
９
３
３
１
１
０．９８
Ｋ１
３．５２ ３．６９ ２．４５ ２．７８
Ｋ２
４．４３ ４．８５ ５．４８ ４．５１
由 图 ３ 可 见 ＧＳＨ 对 照 品 的 出 峰 时 间 为 １２．９８ｍｉｎ。将图 ４ 与图 ５ 进行比较可以看出， 热水
—１８—
提取所得样品谱图中含有许多其他组分， 表明杂 质含量较多， 样品 ＧＳＨ 纯度为 １３．５６％， 而乙醇提 取所得样品谱图中部分组分峰面积减小， 甚至已 经不存在， 表明杂质含量减少， 样品 ＧＳＨ 纯度为 １９．８６％。测定结果表明， 乙醇提取法所得样品蛋 白质、核酸、色素等杂质溶出量少， 纯度较高， 从而 减少了后续分离纯化的工作量。
图 ２ 料液比对热水提取 ＧＳＨ 的影响
由图 ２ 可看出， 随着加水量的增加， 浸出的 ＧＳＨ 含量提高， 加水 ４ 倍体积时， 提取 ＧＳＨ 含量 达 １．８６５％， 随加水量的增加， ＧＳＨ 含量无明显提 高， 考虑到加水量过高会延长上清液浓缩时间， 加 大不必要的工作量， 故加水量选取为 １：４。 ２．２ 乙醇提取
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法
谷胱甘肽过氧化物酶检测方法是一种用于测定生物体内谷胱甘
肽过氧化物酶（GPx）活性的方法。
本方法基于GPx的催化作用，将
过氧化氢还原成水，并在反应过程中消耗还原型谷胱甘肽（GSH），使其转变为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。
测定反应前后GSH和GSSG的比例变化，即可计算出样品中GPx的活性。
常用的谷胱甘肽过氧化物酶检测方法包括紫外-可见分光光度法、荧光法和色谱法等。
其中，紫外-可见分光光度法是常用的定量方法，其原理是利用GPx催化剂将过氧化氢还原为水，测定反应前后NADPH 浓度的变化。
荧光法利用GSH与荧光探针的反应性，在荧光信号变化的同时测定GPx活性。
色谱法则是在高效液相色谱仪上使用GSH和GSSG标准品，通过检测样品中这两种化合物的浓度，计算出GPx活性。
总体而言，谷胱甘肽过氧化物酶检测方法是一种有效的检测生物体内GPx活性的方法，适用于疾病诊断和治疗效果评估等领域。
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谷胱甘肽分子基因工程制造法工艺流程
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