实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点
一．实验目的
1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；
2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理
等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤
1.凝胶制备
按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。每组4管，每管加胶液1.8ml。混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比
1ml
凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯
酰胺0.8%）
10%过硫酸铵0.02ml
水 2.68ml
载体两性电解液0.15ml
蛋白样品液0.1ml,0.05ml
TEMED 0.02ml
2.电泳
吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。于电泳槽下槽加
入0.2％的500ml 硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min 后，停止电泳，全程约需3h 。
3.剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。剥离后，量出并记录凝胶的长度。
4.固定
取其中的凝胶条3根置于一个小培养皿内，倒入10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液用直尺量出胶条长度L 1和正极端到蛋白质白色沉淀带中心，即聚焦部位的长度L 2。
5.pH 梯度的测量
切段法：将未经固定的1根胶条，按照从正极端(酸性端)到负极端(碱性端)的顺序切成相等的10段，按次放人有标号的、装有0.0lM 氯化钾的试管中，浸泡过夜。然后用pH 计测出每管浸泡液的pH 并记录。
四．实验结果
1.凝胶条的长度及染色蛋白带的位置
凝胶条编号 1 2 3 4 固定前的长度L 0
7.8cm 7.8cm 7.4cm 7.7cm 固定后的长度L 1 7.7cm 7.8cm 7.4cm
未染色，测pH 梯度
蛋白带距酸端距离L 2 1.3cm 1.4cm 1.3cm 蛋白质距正极实际长度L S
1.32cm 1.4cm 1.3cm
2.pH 梯度表及其相应标准曲线 标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 长度/cm
0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 pH 值 3.05 3.72 5.04 6.76 7.24 7.99 8.62 9.58 10.1
4
10.18
蛋白质样品等电点的计算：
蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度=固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离*固定前凝胶条长度/ 固定后凝胶条长度
则将上述数据代入L
S =L
2
*
1
L
L
，求出蛋白质距正极实际长度L
S
分别为1.3cm、1.4cm、
1.3cm。由凝胶条1、2和3及其相应蛋白带距离可计算出蛋白带距酸端的平均距离：(1.3+1.4+1.32)/3=1.34
②计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。
得出其标准公式为：y = 0.8372x + 2.6273
则待测蛋白质的等电点为0.8372*1.34+2.6273=3.75
五．实验分析及讨论
（1）实验结果测得的样品蛋白的等电点为3.75，通过查常见蛋白质等电点参考值表格可知，其为β-卵黄脂磷蛋白。由于记录凝胶长度及蛋白质距正极的距离存在读数误差，所以也可能是伴花生球蛋白（3.7-5.0）。
（2）等电点聚焦测蛋白质等电点分辨率高，可将等电点相差0.01—0.02pH单位的蛋白质分开。不像一般电泳易受扩散作用影响，使区带越走越宽；聚焦电泳则能抵消扩散作用，使区带越走越窄。同时，很稀的样品也可以聚焦而浓缩，实验操作起来也简单方便。
（3）其存在其不足之处是在实验操作过程当中，读数的取值、样品溶液是否含盐、在等电点时蛋白质是否溶解或变性，都会影响实验结果。因为盐会增大电流量，产生热量；盐分子移至两极时，将产生酸或碱，中和两性电解质。由于这些影响因素的存在，个人认为利用这一种方法还不足以鉴定出蛋白质种类。
附常见蛋白质等电点参考值
蛋白质等电点测定
离表面越远，过剩的反离子越少， 直至在溶液内部反离子 蛋白质等电点测定 及性质实验 、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 、原理: 固体颗粒在液体中为什么能够带电? 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本 身发生电离作用而使离子进入溶液， 以致使固液两相分别带有不同符号的电荷， 由于电中性 的要求，带电表面附近的液体中必有与固体 表面电荷 数量相等但符号相反的多余的反离子。 在界面上 带电表面和反离子 形成了双电层的结构。 在两种不同物质的 界面上，正负电荷分 别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于 1879年 Helmholz 提出平板型模型；1910年Gouy 和1913年Chap man 修正了平板型模型， 提出了扩 散双电层模型；后来 Stern 又提出了 Stern 模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范 德华力）而和表面紧密结合，构成 吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地 分布在溶液中，构成双电层的 扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在 扩散层 中反离子的浓度远大于同号离子。 紧密层（Stern 层〉 +++++^+++ 9 反号离子溶剂分子 扩散层
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧 密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的 电势差称为Z电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式？ Z电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。Z电势的大小由Zeta电位表示， 其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1?100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多 亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而 形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间 不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利 用蛋白质的胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液 在碱性溶液中羧基形成-C00-而带负电 中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正 电， COO-COO J p\+ 0H- NH2 兼性痒孑 pH>pI pK = pl pl 电殛申：拓向配覆不暮动 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一 pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。
发酵实验报告三、乳酸菌的分离和酸奶的制作
发酵工程学实验报告实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作 学院生命科学学院 专业应用生物教育 班级12应生A班 姓名李顺昌 学号124120218 实验课程乳酸菌的分离和酸奶的制作 指导教师许波 开课学期2014—2015学年下学期
实验三、乳酸菌的分离和酸奶的制作小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤 一、实验目的 1.掌握分离纯化微生物的基本方法 2.掌握酸奶制作的基本原理 3.学会酸奶的制作方法 二、实验设备与材料 1、仪器设备：三角瓶、平皿、试管、移液管、玻璃涂布棒、灭菌锅、超净工作台、培养箱、恒温摇床、冰箱等。 2、材料：市售酸奶、奶粉、白糖、棉花、酸奶瓶（自备，1个/人）等。 3、培养基：乳酸菌分离用 乳酸菌分离用培养基：牛肉膏：0.5％；酵母膏：0.5％；蛋白胨：1％；葡萄糖：1％；乳糖：0.5％；NaCl：0.5％；琼脂：2.5％；pH6.8。 配制250mL/组，装于2个三角瓶 三、实验原理 1、酸奶制作的基本原理 （1）酸奶：以牛奶为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种乳制品饮料。 （2）生理生化原理 牛奶（乳糖）→接种乳酸菌→β-D-半乳糖苷酶→乳糖（半乳糖和葡萄糖）→乳酸发酵（葡萄糖）→乳酸→破坏钙-酪蛋白-磷酸复合物的稳定性→蛋白质凝结→酸奶 2、提供适宜的生长条件、采用一定的微生物分离纯化方法，就能够从酸奶中分离出乳酸菌。 3、酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对人体的肠胃消化道疾病有良好的治疗效果。 四、实验方法步骤
（一）乳酸菌的分离纯化——稀释涂布平板法 1、倒平板（约6块/100ml） 2、制备酸奶稀释液 （1）将0.5mL酸奶吸入4.5mL无菌水（自备）中，摇动5min； （2）用无菌吸管吸出0.5mL酸奶悬液，加入盛有4.5mL无菌水的试管中，充分混匀，制备得到10-2稀释液； （3）再从中吸出0.5mL加入盛有4.5mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3稀释液； （4）以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6酸奶稀释液。 3、涂布 用无菌吸管分别吸取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀（每个稀释度涂2块平板）。 4、培养：37℃倒置培养2-3d 5、观察菌落特征（周二中午） 扁平型菌落：大小为2-3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为细杆状； 半球状隆起菌落：大小为1-2mm隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状； 礼帽形突起菌落：大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，有酪蛋白水解透明圈，染色镜检亦为链球状。 6、分离纯化：（周二）挑取符合上述特征的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养约2d（下周四中午）；如发现杂菌需重复上述步骤（纯化）直到获得纯培养。 （二）酸奶的制作 1、菌种的制备 （1）将分离纯化所得到的乳酸菌分别接种于LB培养基中（30ml/瓶）（下周4早上）； （2）37℃、200r/min摇瓶培养约48h （下周5晚）。 2、牛奶的配制
蛋白质工程试题
1.蛋白质分子的构型与构象 构型：是分子中原子的特定空间排布。当构型相互转变时，必须有共价键的断裂和重新形成。基本构型有L-型和D型两种。这种构型无法通过单键的旋转相互转换。 构象:是组成分子的原子或基团围绕单键旋转而成的不同空间排布，构象的转换不要求有共价键的断裂和重新形成,在化学上难以区分和分离。 2.内核假设原理所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保守内部区域。这样的区域一般由氢键连接而成的二级结构单元组成。内核假设原理就是所有蛋白质的折叠形式主要决定于其内核中残基的相互作用和组织形式。遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创造出超越天然蛋白质所具有二级结构的新蛋白质二级结构。 3. van't Hoff焓平衡常数与焓/熵的关系式为：－RT lnK = △H - T△S。取对数可以变为： lnK = －△H/RT + △S/R。进一步推导可以变为：d（lnK）/d（1/T）= －△H/R。基于此，以lnK对1/T可以得到一条曲线。在这条曲线上任何一点的斜率就是△H/R，其中的△H称为van't Hoff焓。通过解析van't Hoff焓随温度变化的曲线特点，可以用于测定蛋白质体系构象平衡的转变，主要是两态转变模型的分析。也就是通过这样的曲线分析，可以预测蛋白质天然构象退在折叠时的容易程度。 4. 盒式突变法也称为片断取代法（DNA fragment replacement）。这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。 5、熔球态在折叠途径中第一个可以观测到的中间体是柔性无序的为折叠多肽链卷折成局部有组织的球状体，称为熔球体melton globule。熔球体具有天然态的大多数二级结构，但不如天然结构致密，蛋白质内部的密堆积相互作用尚未形成，环肽区和表面结构多数处于未折叠状态，侧链可以活动。非折叠态卷折成熔球体包含了蛋白质折叠的主要奥秘—疏水侧链的包埋。 6. 反向折叠设计在蛋白质工程中，全新蛋白质设计是以弥补天然蛋白质结构和功能在应用方面的不足为目的，根据人类所希望的结构和功能，采取工程手段，来人工设计新的氨基酸序列，这样的设计研究称为反向折叠研究。在全新蛋白质设计的反向折叠研究中，需要采取的基本策略是通过设计新的氨基酸序列,来加强或者减弱蛋白质的某些相互作用力，使设计的序列能最终具有所希望的结构和功能。 7. 功能基团的特异性修饰 蛋白质中，不仅末端氨基酸具有氨基和羧基，很多链中氨基酸侧链也具有羟基、巯基、氨基和羧基等能进行特征性化学反应的功能基团。利用这些功能基团的化学反应性可以进行蛋白质功能基团的特异性修饰。 8. 基因突变技术 在基因水平上设计并使某特定基因发生变异，对该基因所编码的蛋白质进行改造，在突变基因表达后、用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 9. 融合蛋白质 重组DNA技术允许在体外产生不同基因和基因片段之间的融合，并且通过基因融合产生的蛋白质叫做融合蛋白质。
蛋白质的等电点测定
蛋白质的等电点测定 一、蛋白质等电点的测定 1．目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2．原理 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3．器材 （1）水浴锅（2）温度计 （3）200mL锥形瓶4）100mL容量瓶 （5）吸管（6）试管 （7）试管架（8）乳钵 4．试剂 （1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200mL 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL1mol／L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50 C水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 （2）1.00mol／L醋酸溶液100mL （3）0.10mol／L醋酸溶液100mL （4）0.01 mol／L醋酸溶液 50mL 5．操作 取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 （2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀——管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最 混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
牛奶中提取酪蛋白
牛奶中提取酪蛋白 [目的与要求] 1、了解等电点沉淀法 2、学习从牛奶中制备酪蛋白的方法 3、加深对蛋白质等电点性质的理解 [原理] 蛋白质是一种亲水胶体，在水溶液中蛋白质分子表面形成一个水化层。另外，蛋白质又是一种两性离子，在一定pH溶液能够维持一个稳定的状态。但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法主要利用两性电解质分子在等电点时溶解度最低的原理，而多种两性电解质具有不同等电点而进行分离的一种方法。 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。 但单独利用等电点沉淀法来分离生化产品效果并不太理想，因为即使在等电点时，有些两性物质仍有一定的溶解度，并不是所有的蛋白质在等电点时都能沉淀下来，特别是同一类两性物质的等电点十分接近时。生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，这样沉淀的效果较好。 本实验目的是使学生运用等电点沉淀法制备酪蛋白，从中加深对蛋白质等电点性质的理解。 [方法和步骤] 1、取预先放冰箱中冷却的消毒牛奶6mL，3 000r/min离心10min，除去脂肪层的乳液置50毫升烧杯内，加热至40℃左右，在搅拌下慢慢加入10mL左右预热的醋酸-醋酸钠缓冲液，此时混浊液中有大量絮状物沉下。冷至室温，3 000r/min离心10min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。 2、用蒸馏水洗沉淀三次（每次5mL左右），3 000r/min离心10min，弃去上清液。 3、将沉淀置研钵中，研碎后，渐加5mL 95%乙醇，静置片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀二次（每次5mL），最后用无水乙醚洗沉淀二次（每次5mL），抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白制品（称重，记录）。 5、酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.1g，置10毫升烧杯中，加5mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液，搅匀，隔水加热，溶解后转移至10毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液并入容量瓶中，最后加水至刻度处，摇匀，置冰箱中保存备用。 [结果与计算] 计算酪蛋白含量和得率： 1、含量：酪蛋白克数/100mL牛奶 2、 100 %? = 理论含量 测得含量 得率 式中理论含量3.5g/100mL牛奶
蛋白质组学试题整理 - 副本
蛋白质组学相关试题及答案 1…Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 2…. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 3. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information（2）adapted to separation and identification methods（3）different samples,different extraction.蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。 原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 4.Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 5.De novo sequencing(从头测序) unknow peptide从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、离子类型的确定、测序算法以及打分算法。
蛋白质等电点测定
蛋白质等电点测定及性质实验 一、目的： 了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。 二、原理： 固体颗粒在液体中为什么能够带电 当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。 对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。 根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。其余反离子则构成扩散层。 滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。 固体颗粒带电量的大小及测量方式 ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。 对于蛋白质分子来说： 蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。大部分蛋白质分子的表面都有很多亲水集团，这些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子表面而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子表面的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在，使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定，两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或分离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。 蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而带正电，在碱性溶液中羧基形成-COO-而带负电： 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。 等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的分离、提纯和电泳。 蛋白质等电点的测量方式：溶解度最低时的溶液pH。
实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定
实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定 一、目的和要求 1.了解蛋白质的两性解离性质。 2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。 二、原理 蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。 在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。 三、试剂和器材 1.试剂 0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液； 0.04%溴甲酚绿指示剂； 0.02N盐酸； 0.1N醋酸溶液； 0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液； 0.02N氢氧化钠溶液 2.器材
试管及试管架；滴管；吸量管（ 1、5ml） 四、操作方法 1.蛋白质的两性反应 （1）取1支试管，加 0.5%酪蛋白溶液20滴和 0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。观察溶液呈观的颜色，并说明原因。 （2）用细滴管缓慢加入 0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。 （3）继续滴入 0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。 （4）再滴入 0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。 继续滴入 0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？ 2.酪蛋白等电点的测定 （1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。 加入每种试剂后应混合均匀。 试管编号9
生物化学实验四 酪蛋白的制备
实验四酪蛋白的制备 一、目的要求 学习和掌握从牛乳中制备蛋白的原理和方法；掌握等电点沉淀法提取蛋白质的原理和方法；掌握离心方法。 二、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7.利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、材料、器材与试剂 1〉材料 鲜牛奶。 2〉器材 离心机、抽滤装置、精密pH试纸、电炉、烧杯、温度计、玻棒、漏斗、滤纸、滴管。3〉试剂 (1) 95%乙醇。 (2) 无水乙醚。 (3) 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。 A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称取CH3COON a·3H2O 54.44g，用蒸馏水定容至2000ml。 B液：0.2mol/L醋酸溶液，称取优级纯醋酸(含量大于99.8%)24.0g，定容至2000ml。 取A液1770ml，B液1230ml混合即可得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。 (4)乙醇-乙醚混合液的配制：乙醇-乙醚=1:1(体积分数)。 四、实验步骤 (1)将20ml牛奶加热至40°C，在搅拌下慢慢加入预热至40°C、pH4.7的醋酸缓冲液20ml。用精密pH试纸调pH至4.7，将上述悬浮液冷却至室温，离心15min(3000r/min)，弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。 (2)用水洗1次，离心10min，弃去上清液。 (3)在沉淀中加30ml乙醇，搅拌片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗中离心10min，弃上清液，用乙醇-乙醚混合液洗1次。最后用乙醚洗沉淀1次，抽干或滤纸过滤得到湿的酪蛋白。 (4)将沉淀摊开，风干；得到酪蛋白纯品。 五、结果及处理 准确称重，得20ml牛乳中酪蛋白含量(g)，按下式计算酪蛋白的得率： 测得含量 得率(%)= 理论含量×100 式中，理论含量为3.5g/100ml牛乳。 实验结果： (1.426-0.795) ×5 得率(%)= 3.5 ×100=90.14%
常见蛋白质等电点参考值
常见蛋白质等电点参考值 常见蛋白质等电点参考值 蛋白质等电点蛋白质等电点 鲑精蛋白［salmｉne]鲱精蛋白［clｕpein ｅ］ 血清白蛋白［seruｍａｌｂumiｎ] 鲟精蛋白［stｕrline］胸腺组蛋白[ｔｈymohistone] 珠蛋白（人）［globin （hｕmaｎ）] 卵白蛋白［ｏｖaｌbu ｉn］ 伴清蛋白［ｃoｎaｌ1２。1 12。１ ４。７—4。 9 １１。71 1０．8 7.5 ４.７ 1;4.59 ６。8,7。1 ３.5 6.3 5。1—５.3 肌红蛋白［myｏgｌobｉｎ］ 血红蛋白（人）［heｍｏgｌ obin(human）］ 血红蛋白(鸡）[hemoglobiｎ（ｈ en）] 血红蛋白（马）［hemoｇlｏbi ｎ(horse）] 血蓝蛋白［ｈemｅryｔhｒin］ 蚯蚓血红蛋白［cｈlorｏcruｏ ｒin］ 血绿蛋白[cｈlorｏｃrｕｏrｉ n] 无脊椎血红蛋白[eｒyｔ 7．０7 7。２3 6.92 4.6－ ６.4 5。6 ４。3－ 4.5 4。6— 6．2 9.8— 10.1 4.47—
ｂumin］ 肌清蛋白[ｍｙoａl bｕmｉn] 肌浆蛋白［mｙoｇen A］β－乳球蛋白［β—lactoｇlｏbuliｎ] 卵黄蛋白［liｖeｔin]γ1—球蛋白（人）[γ１-ｇｌｏｂuliｎ（ｈumaｎ)] γ2-球蛋白（人）[γ2—glｏbulin(hｕｍa ｎ）］ 肌球蛋白A［myosin A] 原肌球蛋白［ｍyosｉn Ａ]４。８－5。 ５.8，6.6， 7。３,８.2 ５.2-5.5 5.1 5。9 ３.４－3。 5 5．5－5.8 ４.８ 6．0 5．1 3.9 3.7－5．０ ４。6-4。 ７ hrocruoriｎs] 细胞色素Ｃ［cｙｔochromｅ Ｃ] 视紫质［rhodopsiｎ］ 促凝血酶原激酶[ｔｈ romboplastｉｎ] α1－脂蛋白［α1-lｉpoprot ｅｉn］ β1－脂蛋白[β１-lｉｐ oproteiｎ］ β—卵黄脂磷蛋白［β－ｌｉｐ oｖitｅｌlin］ 芜菁黄花病毒［turnip yeｌｌ ow vvｉrus] 牛痘病毒[vaｃｃｉnｉa virｕ s] 生长激素［ｓomａtｏｔroｐin] 4.57 5。2 ５．5 5．4 ５.9 ３。75 5。3 6.85 5。７3 5。35 1.0 ８。1 4。9 7．８ ４．5８ 4 3．８3
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应 姓名：指导教师：实验室： 组员：成绩： 第三部分：实验记录与分析 实验现象记录及分析： （一）蛋白质等电点测定 （二）蛋白质的盐析 1．蛋白质的盐析
2．重金属离子沉淀蛋白质 3．有机酸沉淀蛋白质
4．有机溶剂沉淀蛋白质 5．乙醇引起的变性与沉淀
第四部分：课后研讨题 1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。 适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。 2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。 3.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？ 蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。 （1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。 （2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。 （3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。 （4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。 （5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。 教师评阅： 签名
《生物化学》实验指导(8个实验)
生物化学实验指导 吕杰编著 新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室
内容介绍 《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目录 实验一氨基酸纸层析 (4) 实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸 (5) 实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度 (7) 实验四酪蛋白的制备 (8) 实验五葡萄糖标准曲线的绘制 (10) 实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定 (12) 实验七酵母RNA的分离及组分鉴定 (14) 实验八维生素C的定量测定 (16)
实验一氨基酸纸层析 一、实验目的 1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。 二、实验原理 纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器: 层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。 3、试剂： （1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。 （2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀； （3）0. 1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮1—5克，丙酮100毫升 四、实验步骤： 纸层析 (1) 取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm 处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm 画一个“+”作为点样位置，共5个点。 (2) 点样：用毛细管点样，其中2个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外，注意纸的两边不要接触。 (3) 展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线（高约1.5cm，约50－60ml 溶剂），将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。 (4)显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风吹干显色。 五.结果分析： (1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来； (2) 测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。 Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离 =原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离 六、思考题： 1、何谓分配层析法和分配系数？
基因工程测试题经典
xxxXXXXX 学校XXXX 年学年度第二学期第二次月考 XXX 年级xx 班级 姓名：_______________班级：_______________考号：_______________ 一、选择题 （每空？ 分，共？ 分） 1、下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是 A ．蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的 B ．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以不是天然存在的蛋白质 C ．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平（或性状水平）操作 D ．基因工程完全不同于蛋白质工程 2、PCR 是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，下列有关PCR 过程的叙述，不正确的是 A ．变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键 B ．复性过程中引物与DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C ．延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 、四种核糖核苷酸 D ．PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需要酶的最适温度较高 3、35．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。下列有关叙述，正确的是（ ） A ．人体细胞中凝血因子基因的碱基对数目，小于凝血因子氨基酸数目的3倍 B ．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA 分子导入羊的受精卵 C ．在该转基因羊中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中 D ．人凝血因子基因开始转录后，DNA 连接酶以DNA 分子的一条链为模板合成mRNA
4、ch1L基因是蓝细菌拟核DNA上控制叶绿素合成的基因．为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞．技术路线如图所示，对此描述错误的是（） 5、下图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是： A、同种生物的基因组文库大于cDNA文库 B、③表示PCR技术，用来扩增目的基因 C、从基因文库中要得到所需目的基因，可根据目的基因的有关信息来获取 D、只要基因的核苷酸序列已知，就只能通过人工合成的方法获取 6、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序 列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。下列分析中正确的是：
1蛋白质的等电点是指教学提纲
1蛋白质的等电点是指( ) 蛋白质分子的正电荷与负电荷相等时溶液的pH值 2 蛋白质高分子溶液的特性有( ) 黏度大、 3维持蛋白质三级结构的主要键是( )次级键 4 DNA水解后可得下列哪组产物( ) 胞嘧啶、胸腺嘧啶 5 蛋白质的主要特点是( ) . 生物学活性丧失 6 肽类激素诱导cAMP生成的过程是( ) 激素受体复合物使G蛋白结合GTP而活化，后者再激活腺苷酸环化酶 7 芳香族氨基酸是( ) 苯丙氨酸 8 蛋白质分子中主要的化学键是( ) 肽键 9对酶来说，下列不正确的有( ) 酶可加速化学反应速度，因而改变反应的平衡常数 10盐析沉淀蛋白质的原理是( ) 中和电荷，破坏水化膜 11 酶化学修饰调节的主要方式是( ) 磷酸化与去磷酸化 12 关于蛋白质的二级结构正确的是( ) 是多肽链本身折叠盘曲而形成 13 DNA复制的叙述错误的是( ) 两条子链均连续合成 14 关于酶的叙述正确的一项是( ) 所有酶的本质都是蛋白质 15下列脱氧核苷酸不存在于DNA中的是, . dUMP 16 关于组成蛋白质的氨基酸结构，正确的说法是( ) 在α-碳原子上都结合有氨基或亚氨基 17 核酸对紫外线的最大吸收峰在( ) 260nm 18关于酶的非竞争性抑制作用正确的说法是( ) Km值不变 19非竞争性抑制作用与竞争性抑制作用的不同点在于前者的( ) 提高底物浓度，Vm仍然降低 20 下列影响细胞内cAMP含量的酶是( ) 腺苷酸环化酶 21. 关于酶与温度的关系，错误的论述是（）D. 酶的最适温度与反应时间有关 22变性蛋白质的特性有( ) B. 生物学活性丧失 4. 逆转录时碱基的配对原则是( ) B. U－A 5. 分子病主要是哪种结构异常（） A. 一级结构 6. DNA分子中的碱基组成是( ) A. A＋C＝G＋T 7. 蛋白质的一级结构和空间结构决定于( ) C. 氨基酸组成和顺序 8. 关于碱基配对，下列错误的是( ) E. A-G，C-T相配对 9. 参加DNA复制的是( ) D. DNA指导的DNA聚合酶 10. DNA分子杂交的基础是( ) A. DNA变性后在一定条件下可复性 11. 酶的活性中心是指( ) A. 由必需基团组成的具有一定空间构象的区域 13. 关于肽键与肽，正确的是( ) A. 肽键具有部分双键性质 14. 酶原所以没有活性是因为( ) B. 活性中心未形成或未暴露 15. 有关cAMP的叙述是( C. cAMP是激素作用的第二信使 16. 下列具有四级结构的蛋白质是( ) D. 乳酸脱氢酶H型和M型两种亚基组成的四聚体 17 关于酶的竞争性抑制作用的说法正确的是( ) D. 增加底物浓度可减弱抑制剂的影响 19. 蛋白质变性和DNA变性的共同点是( ) A. 生物学活性丧失 20. 在核酸中占9%-11%，且可用于计算核酸含量的元素是( ) E. 磷 21. 维持DNA双螺旋结构稳定的因素有( ) B. 碱基对之间的氢键 22. DNA分子中的碱基组成是( ) A. A＋C＝G＋T 1. 嘌呤环中的氮原子来自( ) C. 谷氨酰胺 2. 关于尿糖，哪项说法是正确的B. 尿糖阳性是肾小管不能将尿糖全部重吸收 3. 激素敏感脂肪酶是指( ) D. 脂肪细胞中的甘油三酯脂肪酶 4. 正常人摄入糖过多后，不可能发生的反应是E. 糖转变为蛋白质
实验报告-从牛奶中分离酪蛋白
实验报告 一、实验名称：从牛奶中分离酪蛋白 二、实验目的： 1.学习从胶体中提取某一类物质的方法。 2.学习蛋白质的各种颜色反应及其原理。 三、实验原理： 1.蛋白质是两性化合物，溶液的酸碱性直接影响蛋白质分子所带的电荷。当调节牛奶 的pH值达到酪蛋白的等电点（pl）4.8左右时，蛋白质所带正、负电荷相等，呈电 中性，此时酪蛋白的溶解度最小，会以沉淀形式从牛奶中析出。 2.缩二脲反应原理：具有两个或两个以上肽键的化合物在碱性条件下与Cu2+反应,生 成红紫色的络合物。所有的蛋白质均有此显色反应。 3.蛋白黄色反应原理：硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，在加热状态下产生了黄色硝 基苯衍生物，再加碱颜色加深呈橙黄色。这是含有芳香族氨基酸特别是含有酪氨酸 和色氨酸的蛋白质所特有的颜色反应。 4.茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的 缩合物。此反应为一切氨基酸及α-氨基酸所共有。 四、实验步骤及现象： 1.取50mL脱脂牛奶于150mL烧杯中，用热水浴加热至40℃，维持此温度，边搅拌 边加稀醋酸（1：9）溶液约2mL——有白色沉淀析出。 2.继续搅拌并使悬浊液冷却至室温，然后将混合物转入离心杯中，于3000r/min离心 15min。 3.离心完毕后，上清液倒入乳糖回收瓶中，沉淀用95%的乙醇（20ml）搅匀，然后用 布氏漏斗减压过滤，用乙醇-乙醚（1：1）混合液洗涤沉淀2次，每次约10ml，最 后用5ml乙醚洗涤沉淀一次，减压过滤至干——得到干燥的白色固体。 4.将干粉铺于表面皿上，称量并计算牛奶中酪蛋白含量。 5.称取0.5g酪蛋白，溶解于0.4M氢氧化钠溶液的生理盐水（5mL）中，然后滴加3-4 滴1%硫酸铜溶液，振荡试管——溶液变成紫色。 五、实验数据： 空表面皿的质量m0 =28.15g 表面皿与酪蛋白的总质量m1 =31.78g 牛奶中酪蛋白的质量m= m1 - m0 =3.63g 六、讨论与感想： 1.牛奶是一种胶体，在正常情况下是均一稳定的，要想分离出其中的某一成分，就应 该想办法使这种成分变成沉淀析出。通过本次实验，我知道了可以通过调节胶体的 酸碱性，来改变蛋白质分子所带电荷，使其达到等电点。此时蛋白质分子间的电荷 作用力最小，分子间没有了间隙，浮力减小，蛋白质就会沉淀。而实验中50ml牛 奶和2ml稀醋酸（1：9）所配成的混合液的pH恰好在4.8左右，正好是蛋白质的
酪蛋白的制备
上海大学生命科学实验中心 实验预习报告 课程：姓名：日期： 学号：同组者：指导老师： 实验时间：温度：湿度： （一律用A4纸、钢笔书写或打印，不得涂改，经教师签字后方为有效，附在实验报告中一并交。 如无此原始记录或丢失，报告不批示成绩） 实验名称：酪蛋白的制备 1.目的：学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，并依此加深对等电点概念的印象。 2.原理、仪器设备、材料和试剂： 原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。 在处于其等电点时，兼性离子/粒子在溶液中的溶解度降低；如果我们将牛奶的pH 调到4.7，就可获得酪蛋白沉淀；下一步，用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。 试剂：95%乙醇；无水乙醚；乙醇—乙醚混合液(V/V=1∶1) 。 0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL： A液：称取NaAc 3H2O 54.44g，定容至2000mL。 B液：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。 仪器：离心机；抽滤装置；研钵；布氏漏斗；容量瓶。 3.操作步骤及现象记录 1．将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃。将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液。 2．用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温，3000rpm离心
【生物】6年高考题按知识点分类汇编WORD版蛋白质工程
蛋白质工程 （2012天津）8.黄曲霉毒素B1（AFB1）存在于被黄曲霉菌污染的饲料中，它可以通过食物链进入动物体内并蓄积，引起瘤变。某些微生物能表达AFB1解毒酶.将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性。 回答下列问题： （1） AFB1属于类致癌因子。 （2） AFB1能结合在DNA 的G 上，使该位点受损伤变为G ' ，在DNA复制中，G '会与A 配对。现有受损伤部位的序列为，经两次复制后，该序列突变为。 （3）下图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图 据图回答问题： ①在甲、乙条件下培养含AFB1解毒酶基因的菌株，经测定，甲菌液细胞密度小、细胞含解毒酶：乙菌液细胞密度大、细胞不含解毒酶.过程l 应选择菌液的细胞提取总RNA ，理由是 ②过程Ⅱ中，与引物结合的模版是 ③检测酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用方法。 （4）选取不含AFB1的饲料和某种实验动物为材料，探究该AFB1解毒酶在饲料中的解毒效果。实验设计及测定结果见下表： 据表回答问题： ①本实验的两个自变量，分别为。 ②本实验中，反映AFB1解毒酶的解毒效果的对照组是。 ③经测定，某污染饲料中AFB1含量为100μg/kg ，则每千克饲料应添加克AFB1解毒酶.解毒效果最好.同时节的了成本。 （5）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高每的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的序列。
【答案】（1）化学（2） （3）①甲甲菌液细胞的AFB1解毒酶基因已转录生成了mRNA，而在乙菌液细胞中该基因未转录②AFB1解毒酶基因的 cDNA. ③抗原-抗体 杂交 （4）① AFB1的有无和AFB1解毒酶的含量。 ② B组（或B组+A组）③ 5 （5）脱氧核苷酸序列。 【解析】黄曲霉毒素B1 （AFB1）存在于被黄曲霉菌污染的饲料中，它可以通过食物链进入动物体内并蓄积，引起瘤变。某些微生物能表达AFB1解毒酶.将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性。 （1）黄曲霉毒素B1（AFB1）是化学物质，AFB1属于化学类致癌因子。 （2）AFB1能结合在DNA 的G 上.使该位点受损伤变为G ' ，在DNA复制中，G '会与A配对。 现有受损伤部位的序列为，经两次复制后，该序列突变为。 （3）①在甲、乙条件下培养含AFB1解毒酶基因的菌株.经测定.甲菌液细胞密度小、细胞含解毒酶：乙菌液细胞密度大、细胞不含解毒酶.过程l 应选择甲菌液的细胞提取总RNA ，理由是因为甲菌液细胞含解毒酶，意味着完成了基因的表达，所以应选择甲菌液的细胞提取总RNA ②过程Ⅱ中，根据图示，可以看出与引物结合的模版是cDNA. ③检测酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，检测对象为蛋白质，应采用抗原-抗体杂交方法。 （4）①本实验的两个自变量，分别为AFB1的有无和AFB1解毒酶的含量。 ②本实验中.反映AFB1解毒酶的解毒效果的对照组是B组。 ③经测定，某污染饲料中AFB1含量为100μg/kg ，则每千克饲料应添加5克AFB1解毒酶.AFB1的残留量最少，解毒效果最好.继续添加AFB1解毒酶解解毒效果不变，因此节约了成本。 （5）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列。 【试题点评】本题以“黄曲霉毒素B1”为材料背景，考查了致癌因子，DNA复制，基因工程，蛋白质工程和实验设计，是一道很好的综合题，考查学生的知识的理解和运用能力，以及对实验分析能力和分析探究能力。难度适中。 （2012广东）29 .（16分）食品种类多，酸碱度范围广。生物兴趣小组拟探究在食品生 产应用范围较广的蛋白酶，查阅相关文献，得知：