根癌农杆菌介导的植物遗传转化1
烟草遗传转化实验报告
烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。
农杆菌转化法基本操作与理论PPT课件
三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
农杆菌介导转化法
生物技术08-1 梁荣洪
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农 杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA， 农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转 化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区， 借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合， 然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆 菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介 导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应 用。
二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
根癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化体系的建立
摘 要： 苜蓿基 因型是 限制遗 传转 化 的关 键 因素之 一 。从 １ ３份苜 蓿材料 中筛 选 出一份具 有 高频再 生潜力
的基 因型 一公 农 １号 ， 以该 品 种 为受 体转 化 Ｎ ＋ ＋ 向转 运蛋 白基 因 ， 化 了遗 传转 化条 件 ， 并 ａ／ 逆 Ｈ 优 建立 了农杆 菌介 导 的苜蓿遗 传转 化 系统 ， 得 了大量 的转基 因植 株 ， 子检测 证 实 目的基 因已经 整合 到苜蓿 基 因组 中。 获 分 关 键词 ： 苜蓿 ； 因型 ； 基 遗传 转化
中图分 类号 ：５ １ ￥ ４ 文 献标识 码 ： Ａ
Ｅｓ ａ ｉｈ ｎ ｆＧｅ ｅ ｉ ａ ｓ ｏｒ ａ ｉｎ Ｓｙ ｔ ｔ ｂｌ ｉ ｉｇ Ａｇｒ ｂ ｃ ｅｒ ｍ — ｓ ｃ Ｕｓ ｎ ｏ ａｔ ｉ ｕ
ｍｅ ｉｔｄｉ Ａｌ ｌ Ｍｅ ｉａ ｏｓｔ ａ ｄａｅ ｆ ｆ ｎ ａ ａ（ ｄｃｇ ａｉ ） ｖ
ａ ｆ ｌａ ｗｎｉ ｈｉ ｈ ｒ ｕｅ ｙ —ｅ ｎ ｒ ｔｏ ｐｏ ｅ ｉ ｌ ｌａ ｆ ｏ ｎｇ ｇ ｆｅｑ ｎｃ —ｒ ｇｅ ｅ ａ ｉ ｎ ｔ ｎｔａ ｗａ ｓ ｒ ｅ ｄ ｒ ｍ １ ｃ ｓ ｃ ｅ ｎｅ ｆｏ ３ ｕｈｉ ａ ｓ ｆ ｌａ ｆ ． Ｗ ｅ ｖ ｒ ｏ ａ ｆ ｌａ ｏ ｔｍｉ ｅ ｈ ｅ ｔｃ ｔａ ｆ ｒ ｔｏｎ ｆ ｃ ｏｒ ，ａ ｕｃ ｅ ｄｅ ｎ ｅ ｔ ｂｌｓ ｉ ｇ ｇ ｎｅ ｉ ｒ ｎ ｆ ｒ ｔｏ ｙｓｅ ｐ ｉ ｚ ｄ ｔ ｅ ｇ ｎｅ ｉ ｒ ｎｓ ｏ ｍａ ｉ ａ ｔ ｓ ｎｄ ｓ ｃ ｅ ｄ ｉ ｓ ａ ｉ ｈ ｎ ｅ ｔｃ ｔ ａ ｓ ｏ ｍａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｍ ｕｓｎｇ Ａｇ ｏ ａｃ ｅ ｉ ｉ ｒ ｂ ｔ ｒｕｍ—ｍｅ ａ ｅ ｎ ｔ ｓｃ ｄｉ ｔ ｄ ｉ ｈｉ ｕｈｉ ａ ．Ａｍｏ ｔｏ ｒ ｎｓ ｅ ｃ ｐ ａｎ ｓｗｅ ｅ ｏ ｔ ｉ ｄ，ａ ｌ ｃ ａ ｖｒ ｕｎ ｆｔ ａ ｇ ｎｉ ｌ ｔ ｒ ｂ ａ ｎｅ ｎｄ ｍｏ ｅ ｕｌ ｒ ａ ｓ ｙ ｒ ｓ ｔ ｎ ｃ ｔ ｄ ｔ ｔｇｅ ｆｉ ｅ ｅｓ ｓ ｉ ｅ ｒ ｔ ｄ ｉ ｏ ｇ ｎｏ ｆａ ｆ ｌａ． ｓ ａ ｅ ｕｌｓｉ ｄｉ ａ ｅ ｈａ ｎｅ ｏ ｎｔ ｒ ｔｗａ ｎｔ ｇ ａ ｅ ｎｔ ｅ ｍｅ ｏ ｌａ ｆ
根癌农杆菌介导的水稻转化研究进展
已分离出大量农杆 菌菌株，并对某些进行了修饰以用于转 化。 用于水稻转化的主要 有两个 Ｔｉ质粒载体 系统 ；共 整合载体 系统和 双元载体系统。前 者是 指 Ｔｉ质粒 上编码致 癌基 因的序列被一 段 ｐＢＲ３２２ＤＮＡ所 取代 ，带外源基因的 ｐＢＲ３２２衍生中间载体由大肠 杆菌转入农杆菌后，二者相 同的 ｐＢＲ３２２序 列友生 同源重组 ．外源 基 禹就此整合在缴械 Ｔｊ质粒 上。后者是 指在 一十农杆 菌株系 中
首倒报道该法获得转化 植株是 １９９３年，此后 ，一 些实验 室相 继获 得了不 同亚种 的水稻转 基 因植株。详见表 １： ２ 影响农杆菌 升导转 化水 稻的因 素
由农杆菌舟导来转化水稻是否成功 ．受到根多 因素的影响 ，其 中至关重要 的包括 ：水稻基 因型．接种组织类型，幼嫩程度 ．载体类 型，农杆菌菌系，供选择的标记基 因和选择剂 ，组 织培养 条件等 。 ２．１ 水 稻 基１８卷第 ２期 ２００２年 ４月
生 物 学 杂 志 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ
文章 编号 ：１００８－９６３２（２００２）０２－０００４－ ０４
Ｖ ｏ１．１９ Ｎ ｏ．２ Ａ ｐｒ，２００２
根 癌 农 杆 菌介 导 的水 稻 转化 研 究进 展
何迎 春 ，高 必 达 ，易 图永 ，任 春 梅
（湖 南农 业大 学植保 系，湖 南长沙 ４１０１２８）
摘 要 ：农杆 菌舟导的水稻基因转化是水稻基 因转化的热门。表 文对由农轩 菌介导转化获得 的水稻品 系（品种 ），影响农杆 菌舟 导转化的因素．农轩 菌浸染的方法，外源基 因的检 刹和遗传等方 面作踪合论述，并提 出 了农杆 菌介 导转化水稻 的前示。
根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究
根癌农杆菌介导反义fad2-1基因转化大豆的研究周延清;刘艳菊;李敏;段红英;周春娥;王芳;苑保军【摘要】通过根癌农杆菌介导法将反义fad2-1基因导入大豆子叶节,研究了农杆菌菌液浓度、预培养时间、共培养时间、恢复培养时间、乙酰丁香酮浓度和pH值对大豆子叶节形成丛生芽的影响,建立了有效的转化体系,获得了转基因大豆再生植株.PCR、PCR-Southern blotting检测结果表明,反义fad2-1基因成功转入并整合于大豆基因组.GC检测结果表明,转反义fad2-1基因大豆种子油酸含量比非转基因大豆种子的油酸含量提高了14.44%,而亚油酸含量降低了20.27%.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2010(000)009【总页数】5页(P17-21)【关键词】大豆;根癌农杆菌;反义fad2-1基因;遗传转化;反义抑制【作者】周延清;刘艳菊;李敏;段红英;周春娥;王芳;苑保军【作者单位】河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;周口市农业科学院,河南,周口,466001【正文语种】中文【中图分类】S565.1大豆(Glycine max L.)是重要的油料、食用和饲料作物,其主要用途之一是压榨大豆油,大豆油用量占全世界食用油的31%[1]。
大豆油90%是脂肪酸,包括硬脂酸、棕榈酸等饱和脂肪酸和油酸、亚油酸与亚麻酸等不饱和脂肪酸。
脂肪酸的组成和配比种类决定植物油的品质[2,3]。
由于不饱和脂肪酸存在较多,使大豆油的保存期缩短。
因此,大豆油往往要经过部分氢化,以减少多不饱和脂肪酸的含量。
在此过程中,自然形成的双键变成反式构象,这种反式不饱和脂肪酸是引起冠心病的主要因素之一。
用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥的研究
剂 草甘 膦 就 是 根据 这 个 原 理消 灭 植 物 的 。其 中Ｇ 一 ｒＡ 因是 来 ２ａｏ基
自草甘 膦 生产 厂 周 围污染 土 壤 中 的荧 光假 单胞 菌 ， 该基 因编 码 的 Ｅ Ｓ 合酶 作 为植 物体 内源 Ｅ Ｓ 合 酶 的 同功 酶 ，其 构 象差 异造 成 对 ＰＰ ＰＰ Ｆ： ５ 一 Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ ３ Ｇ－ ＣＴ Ｇ ＣＴ Ｃ ＡＧ Ｔ Ａ－ 草甘 膦 亲 和 性 下 降 ，从 而使 植 株 获 得抗 药 性 。 为 了研 究 基 Ｒ： ５ ～ Ｔ ＧＣ Ｇ ＴＣ Ａ ｃＧ Ｔ ３ Ａ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ｔ Ｔ一 因在 拟 南芥 中 的表达 ，我 们采 用 花序 浸 染 的遗传 转 化 方法 ，对 拟 扩 增 产 物 为 ３ ５ ｐ Ｃ 条 件为 ９ ℃ 下３ ｉ ７ ｂ ，Ｐ Ｒ ４ ｍ ｎ，９ ４℃３ ｓ Ｃ ０ｅ ， 南 芥进 行 遗 传转 化 ，得 到转 化 后 的种 子 。对 转化 种 子进 行 抗性 筛 ３ ０ｅ ，７ ： ｓ ｃ Ｃ３ ３ ２ Ｃ延 ｍｎ 选 ，得 到抗 性筛 选植 株 ，并进 行Ｐ Ｒ Ｃ 检测 ，进 一 步筛选 阳性 的转 基 ５ ℃３ ｓ ｃ ２ ０ ｅ 复性 并 延伸 ，３ 个循 环 ，７ ￣ 伸５ ｉ ， 将 扩增得 到 的ＰＲ 物用 ０８琼 脂糖 凝胶 电泳检 测 。 Ｃ产 ．％ 因植株 。 １２５ 转 基 因植株 纯 系的 获得 进行 ＰＲ ．． Ｃ 检测 后 ，确认 为转基 因植 １ 料 和 方 法 材 株 。将 转 基 因植株 在适 宜 条件 下 栽种 ， 开花 结籽 ，收获 第二 代种 １ １材料 ． 子 。重复 此步骤 ，直 到获得 几代 转基 因纯系 。 １ １ １ 实验 材 料 转 ．． ’ 因 的大肠 杆 菌 基 — Ｈ 和 农 杆菌 Ｄ５ ａ （ ｇ ｏ ａ ｔ ｒ ｕ ｔ ｍ ｆ ｃ ｅ ｓ Ｐ Ｐ － Ｂ １ ５ Ａ ｒ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ ｕ ｅ ａ ｉ ｎ ）Ｅ Ｓ Ｓ Ｅ Ａ ０ 由实验 室保 存 。拟 ２实 验 结 果 南芥 生态 型Ｃ ｌ Ｃ ｌｍ ｉ ） ｏ （ｏ ｕ ｂ ａ 。 １ １ ２ 主要 试 剂 植物 凝胶 （ ａ ｏ ．． Ｗ Ｋ ），Ｍ 粉 （ ｉ ｍ ），卡那 霉素 Ｓ Ｓ ｇａ （ ｉ Ａ Ｉ Ｎ ） ，Ｃ Ａ ，各种 引物 （ Ｂｏ Ｂ ＳＣ ＩＣ ＴＢ 由英 俊生 物技 术有 限公司 合 成 ），Ｔ ｑ Ｎ 聚 合酶 （ ｉ ｎ ｅ ｉ ｔ ｃ ａ ＤＡ Ｔ ａ ｇ ｎ Ｂ ｏ ｅ ｈ）。 １２方 法 ． １ ２ １ 拟 南芥植 株 的培 养 将 拟 南芥 种子 在４Ｃ 藏箱 中春 化３ 左 ．． ＂冷 ｄ 右 。将 腐殖 士和 蛭石 以２ ｌ 匀 ，经高 压灭 菌后装 入 到直 径为８ ｍ ： 混 ｃ 的塑料 盆 中 ，用 水将 盆 中 的土壤 浇 透 。把 春 化好 的拟 南 芥种 子用
农杆菌介导法
农杆菌介导法实验九植物遗传转化——农杆菌介导法⼀、⽬的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化⽔稻的技术⼆、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能⼒。
下列因⼦与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的⼀段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作⽤元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能⼒丧失，这时⼏乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵⼦转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋⽩VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强⼦；VirD2在T-DNA底链起内切酶作⽤造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋⽩，有2个NLS。
该操纵⼦的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋⽩→VirA被植物创伤信号分⼦激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染⾊体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋⽩、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
遗传转化的方法和技术
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
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实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化
一实验目的
了解植物遗传转化的方法和理论
掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术
二原理
植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。
自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。
农杆菌介导法
土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。
农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
简略地说。
其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。
首先是VirA和virG基因的活化，磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。
三实验材料
烟草KRK26叶片，农杆菌菌株EHA105，质粒的T-DNA含目的基因GFP，卡那霉素抗性基因为选择标记基因，结构如下图所示:
LB Bt nos3 MCS
nos3 nptII nos5 RB
四器具和试剂
灭菌锅,天平,电炉,三角瓶,培养皿,封口膜,镊子,酒精灯,剪刀,琼脂, pH试纸滤纸, MS培养基母液(见表一), NAA,6-BA,蔗糖，葡萄糖, Parafilm, MGL活化培养基, LB培养基,卡那霉素,头孢霉素.氨苄霉素
五实验步骤与说明
1无菌苗的制备
无菌苗的制备按照实验一的方法进行
1农杆菌的活化
超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，取少量接种至含kana的液体LB，28℃180rpm低速摇床震荡培养，约12-16h后LB浑浊，取大约700ul至含Kana的LB 平皿，涂布均匀，吹干后封口放置在28℃的暗培养箱，48-60h后农杆菌长满整个平皿，把培养基表面菌落刮入三角瓶内含AS（乙酰丁香酮）的MGL培养基中，28℃、180rpm 摇2hr，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。
注意：从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱；农杆菌在LB平皿内保存时间不宜过长应尽量保持新鲜；用MGL培养基悬浮农杆菌时，某些菌株若出现结块，可在瓶内放入几根灭过菌的大头针，或者结合减少悬浮时间，在其结块前进行侵染。
1浸染，共培养：
取无菌培养的烟草健壮叶片，切除主茎脉及边缘后将剩余叶片切成长约0.5cm的小正方形，用镊子夹到经活化的菌液中，搅匀，侵染5-7min，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基(MS无机盐+B5有机物+6-BA1mg/l+NAA0.1mg/l+ Mgcl.6H2O 0.3 g/l+蔗糖25g/l+葡萄糖5g/l+ patal gel 2.6g/l, pH 5.85-5.90 )中，19-21℃, 暗培养48-60小时结束共培养。
注意：侵染时烟草叶片稍为干燥可以增加农杆菌的吸附；共培养过程中下胚轴上带过多的菌液容易导致下胚轴在共培养过程中受缺氧和毒害等不利环境条件而大量死亡，因此要通过控制共培养的时间和温度来控制农杆菌的过度生长.
1选择培养
把经过共培养的叶片连同滤纸一起取出浸入含1600mg/l头孢+ mg/l Amp的无菌水中，浸泡15-20 min，倒掉洗液，用无菌水清洗三遍，滤纸吸干水分，吹10分钟使表面稍为干燥；弱光培养；培养30天左右继代一次转入相同的选择培养基中(MS无机盐+B5有机物+6-BA1mg/l+NAA0.1mg/l+ Mgcl.6H2O 0.3 g/l+蔗糖25g/l+葡萄糖5g/l+卡那霉素75mg/l+头孢霉素400 mg/l +Phtagel2.6g/l, pH 5.85-5.90 )
注意：共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持干燥，可以减少农杆菌的污染.
1分化成苗
培养约20天后在叶片边缘开始长出幼芽，将幼芽切下继代培养至芽诱导培养基，待长至3-4
真叶时继代培养到生根培养基。
农杆菌转化烟草叶片技术流程如下
烟草无菌苗的制备农杆菌菌株培养活化
↘↙
烟草叶片小块与农杆菌共培养
↓48小时
用无菌水（含Cef+Amp）冲洗叶片小块
↓
将叶片接种于选择培养基中诱导芽
（含Kana和Cef）
↓
诱导出芽，继代至芽诱导培养基
↓
长出3-4片真叶后继代至生根培养基
↓
再生植株的成苗移栽
六实验结果与思考题
1.根癌农杆菌介到的棉花遗传转化的基本步骤有那些,有那些注意事项?
2.根癌农杆菌介到的棉花遗传转化中使用的共培养培养基和选择培养基的作用分别是什么?为什么要在共培培养基中加入乙酰丁香酮?
3.根癌农杆菌介导的植物遗传转化有那些优缺点?
4.那些措施可以提高根癌农杆菌介导的转化效率?
LB培养基配方
胰化蛋白胨10 g/L，
酵母提取物5 g/L，
氯化钠10 g/L，
PH值7.0
MGL液体培养基配方
胰化蛋白胨5 g/L，
氯化钠5 g/L，
MgSO4.7H2O 0.1 g/L，
KH2PO40.25 g/L，
甘露醇5 g/L，
甘氨酸1.0 g/L，
PH值7.0
芽诱导（共培）培养基（1L）
MS大量元素(20倍) 50ml
微量元素(100倍) 10ml
铁盐(100倍) 10ml
肌醇(100倍) 10ml
NH4NO3 (100倍) 10ml
维生素(1000倍) 1ml
甘氨酸(1000倍) 1ml
6-BA (1mg/ml) 1ml
NAA (0.5mg/ml) 200ul
MgCl2.6H2O 0.3g
蔗糖25g
葡萄糖5g
PH=5.85-5.90 Cef 400mg/l; Kana 75mg/l
六实验结果与思考题
1.根癌农杆菌介导的烟草遗传转化的基本步骤有哪些，有哪些注意事项?
2.根癌农杆菌介导的烟草遗传转化中使用的共培养培养基和选择培养基的作用分别是什么?为什么要MGL中加入乙酰丁香酮?
3.根癌农杆菌介导的植物遗传转化有那些优缺点?
4.那些措施可以提高根癌农杆菌介导的转化效率?。