丹参营养器官中脂溶性成分的动态变化规律

丹参营养器官中脂溶性成分的动态变化规律（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：秦海燕，索志荣，刘文哲【摘要】目的测定丹参营养器官中丹参酮I和丹参酮ⅡA的含量，并揭示丹参生长过程中，丹参酮I和丹参酮ⅡA的动态变化规律。

方法采用反相高效液相色谱法，以Zorbax SB - C18（150 mm ×4.6 mm, 5.0 μm）为色谱柱；甲醇-0.4%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min；二极管阵列检测器：检测波长分别为246, 270 nm；柱温为30℃。

结果丹参叶和茎中均未检出丹参酮I和丹参酮ⅡA，根中丹参酮ⅡA和丹参酮I的含量变化呈“单峰”曲线，丹参酮ⅡA的含量在7月份最高，为2.94%，丹参酮I含量在5月份最高，为0.78%。

结论4月至7月是丹参根中丹参酮积累的关键时期。

【关键词】丹参；营养器官；丹参酮；高效液相色谱Abstract：ObjectiveTo determine the content of TanshinoneⅡA and tanshinoneⅠin different vegetative organs of Salvia miltiorrhiza Bge and discover the accumulation of TanshinoneⅡAand tanshinoneⅠwithin a whole growth period. MethodsHigh performance liquid chromatography was used. The separation was performed on Zorbax SB - C18（150 mm ×4.6 mm, 5.0 μm）column by gradient elution . The mobile phase consisted of CH3OH - 4% aqueous phosphoric acid. The flow rate was 1.0 ml/min. The detection was done at 246, 270 nm and column temperature was 30 ℃.ResultsThere were no tanshinone in the stem and the leaf. TanshinoneⅡA and tanshinoneⅠroughly assumed “the single peak”in the root within a growth period.The highest content of tanshinone ⅡA was in July, up to 2.94% and tanshinoneⅠwas in May, up to 0.78%.ConclusionApril to July is the critical period of tanshinone accumulation in Danshen root.Key words：Salvia miltiorrhiza Bge; Vegetative organs; Tanshinone; High performance liquid chromatography丹参（Salvia Miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，传统以根入药。

其活性成分可分为脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类成分，邻醌型的丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA在丹参中的量较高,有较强的生理活性,是丹参主要有效成分之一［1］，具有扩张血管,降低血液黏度,抗血小板聚集,改善微循环,保护心肌细胞以及抗菌消炎、抗癌等作用［2］。

目前，关于丹参药用成分的药理、提取工艺、检测方法的研究较多，但有关丹参药用成分在整个营养器官动态变化的研究很少。

本文采用高效液相色谱－二极管阵列检测器（HPLC－DAD），研究了丹参脂溶性成分丹参酮I和丹参酮ⅡA在根中的积累规律，旨在为丹参的种植、管理、采收、品质鉴定及控制丹参药材质量提供理论依据。

1 仪器与试药HP1100高效液相色谱仪（美国Aglient公司），包括四元梯度泵（G1311A），二极管阵列检测器(G1315A)；DL-180型超声清洗器(浙江省象山县石浦天电子仪器厂)；FZ102微型植物试样粉碎机（河北省黄骅市齐家务振兴电器厂）；Milli - QG超纯水制备仪（美国Millipore公司）。

甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸为分析纯。

丹参酮I和丹参酮ⅡA对照品纯度均大于99.5%，购自中国药品生物制品检定所。

丹参（Salvia Miltiorrhiza Bunge）实验材料采于西北大学苗圃内的栽培植株（2006年3月自商洛天士力丹参药材基地移栽）。

于2007-04 ～12期间每月20日以随机抽样的方式选择丹参植株6株，摘取各样品株的根、叶片和茎，分别整理，60℃的恒温箱内烘干至恒重，研细，过6号筛后备用。

2 方法2.1 对照品溶液的配制分别精密称取对照品丹参酮I 1.1 mg和丹参酮ⅡA2.2 mg，分别置10 ml量瓶中，用二氯甲烷－甲醇（V/V = 1/9）混合溶剂溶解并定容，摇匀，得丹参酮I 浓度为0.11 mg·ml-1和丹参酮ⅡA浓度为0.22 mg·ml-1的单一成分对照品溶液，作为储备液，其它不同浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。

2.2 供试品溶液的制备精密称量丹参根、茎、叶粉末约120 mg，置25 ml烧瓶中，准确加入二氯甲烷－甲醇（V/V = 1/9）混合溶剂10 ml，称重，超声提取30 min，冷却至室温，再称重，用提取液补足减失的质量，摇匀，取适量用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得丹参脂溶性成分供试品溶液。

2.3 色谱条件美国Zorbax SB - C18（150 mm ×4.6 mm, 5.0 μm）色谱柱；流动相为甲醇－0.4%磷酸，梯度洗脱，其时间程序为0→10→13 min，甲醇体积分数相应为72%→87%→72%，流速1.0 ml·min-1；二极管阵列检测器：检测波长分别为246, 270 nm；柱温30 ℃。

丹参酮I和丹参酮ⅡA的保留时间分别为8.1，10.8 min。

对照品和丹参样品色谱图见图1。

2.4 线性关系考察精密移取“2.1”项所配的丹参酮I和丹参酮ⅡA 储备液一定体积于10 ml量瓶中，稀释，配成丹参酮I浓度分别为0.44，0.88，1.76，3.52，7.04，14.08 μg·ml-1及丹参酮ⅡA浓度分别为4.4，8.8，17.6，26.4，35.2，70.4 μg·ml-1的混合对照品溶液，将上述混合对照品溶液分别平行测定3次（均进样10.0 μl），以平均峰面积Y对浓度C(μg·ml-1)进行线性回归，丹参酮I和丹参酮ⅡA回归方程和相关系数分别为：Y = 74.61C - 118.86，r= 0.999 4；Y = 55.58C - 94.75，r = 0.999 6。

线性范围分别为0.44 ～14.08，4.4 ～70.4 μg·ml-1。

2.5 精密度实验精密吸取丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液10.0 μl，重复进样6次，进行测定，丹参酮I和丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为1.7%，1.9%。

2.6 稳定性实验对丹参（6月根）脂溶性成分供试品溶液在8 h 之内每隔1 h进行考察，结果丹参酮I和丹参酮ⅡA峰面积积分值的RSD分别为2.1%，2.1%（n = 9）。

2.7 重复性实验精密称量丹参（6月根）粉末约200 mg共6份，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液，进行测定，丹参酮I 和丹参酮ⅡA含量的RSD分别为2.3%，2.5%。

2.8 加样回收率实验精密称量丹参（6月根）粉末约60 mg，共6份，每份分别准确加入丹参酮I对照品储备液0.3 ml和丹参酮ⅡA对照品储备液1.0 ml，按“2.2”项操作制备脂溶性成分供试品溶液后，进行测定。

丹参酮I和丹参酮ⅡA的平均加样回收率（n = 6）分别为99.4%，100.1%；RSD分别为2.3%，2.5%。

3 结果按优化的高效液相色谱法对丹参的叶、茎、根中丹参酮I和丹参酮ⅡA的含量进行测定，每个样品重复测定3次，结果以平均含量计，本实验总脂溶性成分含量为丹参酮I和丹参酮ⅡA含量之和。

3. 1 脂溶性成分提取条件的选择分别考察了回流提取法和超声提取法，结果显示：回流提取法和超声提取法均可达到同样的提取效率，但超声提取法提取时间明显缩短，提取操作简单方便，故本实验采用超声提取法。

然后，分别考察了不同比例的二氯甲烷- 甲醇溶剂及不同提取时间两种成分的提取率。

实验结果显示，采用二氯甲烷- 甲醇(1∶9) 作提取溶剂效果最好，超声提取0.5 h，丹参酮I和丹参酮ⅡA的提取率均达到最大，故本实验选择用二氯甲烷－甲醇（V/V= 1/9）混合溶剂超声提取0.5 h。

3.2 色谱条件的优化先后尝试了不同比例的甲醇-水-磷酸作为流动相的等度洗脱以及各种梯度洗脱，对色谱条件进行了优化。

结果表明：随着流动相中甲醇比例的增加，洗脱能力增强，当采用等度洗脱时，在短时间内丹参酮I和丹参酮ⅡA分离效果不理想，因此采用梯度洗脱方式，经试验，本节优化的色谱条件分离效果相对最好。

3.3 检测条件的选择用DAD对丹参酮I和丹参酮ⅡA进行190 ～400 nm全波长扫描，结果丹参酮I和丹参酮ⅡA的最大吸收波长分别为246和270 nm，故本实验采用双波长检测，在246 nm 检测丹参酮I，在270 nm检测丹参酮ⅡA。

3.4 丹参叶和茎中脂溶性成分含量经检测，丹参叶和茎中均未检出丹参酮I和丹参酮ⅡA。

3.5 丹参根中脂溶性成分含量的季节变化在一个生长季节，丹参酮ⅡA和丹参酮I的含量变化规律大体呈“单峰”曲线（图2），丹参酮ⅡA的含量始终高于丹参酮I，丹参酮ⅡA从4月到7月份含量递增，7月份增至最高，为2.94%，以后含量递减，10月份后含量稳定在一个稍低的水平。

丹参酮Ⅰ在4～5月份含量增加，5月份增至最高，为0.78%，以后含量逐渐降低。

总丹参酮含量在7月份最高，约为10月份后稳定期含量的2.47倍。

4 讨论孙群等［3］认为4 ～6月份是丹参第一个营养生长期，根系长度、数量以及生长量均进入快速生长期，结合本实验结果推断，丹参在第1个营养生长期除了生物量增加，根中丹参酮含量也迅速增加，并且这是丹参酮含量增加的重要阶段。

6月份后丹参进入生殖生长阶段，地上部分光合产物主要向以果实为中心的生殖器官运输分配,从而抑制了营养器官的生长［3］。