醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。
醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。
可进行分离菌鉴别。
1.培养基：1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO315g/LPH 6.81.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。
1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。
1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH2PO40.5g/L MgSO40.5g/L PH 6.5-6.82.菌种筛选：2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。
形态与醋酸菌相符即可分离。
2.2混菌法分离：（分离及初筛）适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。
挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。
根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。
醋酸菌分离及鉴定
醋酸菌分离及鉴定一、培养基1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌后培养基温度降到75 ℃左右时加入。
2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。
3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。
二、醋酸菌分离纯化流程样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管保藏→产醋酸定性测试。
三、步骤1 、菌株分离取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。
取10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。
选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。
2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，4℃冰箱保存。
3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极其相似的菌株归为一大类。
4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上混匀后得到菌悬液。
四、鉴定1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。
2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌是一类常见于自然界中的微生物，主要分布于果酱、蜂蜜、果汁等酸性环境中。
醋酸菌能够利用酒精和氧气生成乙酸作为能量源，在食品加工、饮料发酵以及环境保护中具有重要的应用价值。
为了获得高效的醋酸菌菌种，需要进行菌种的分离筛选。
以下是醋酸菌菌种分离筛选方法的一般步骤：1.样品的收集与处理：从酸性环境中收集样品，如水果糖浆、果酱、蜂蜜等。
样品应保持新鲜，并避免污染。
如果样品是固体的，可以通过混合样品和生理盐水来制备悬浮液。
2.菌落计数：将悬浮液经过适当稀释，并均匀分布在含有固体培养基的琼脂平板上。
用细菌计数板或细胞计数器对菌落进行计数。
选取外形典型的菌落进行进一步的分离。
3.菌种分离：根据菌落形态、色素沉积、生理特性等进行分离。
选取外形典型的菌落，利用无菌环针在无菌琼脂平板上进行涂布。
4.筛选培养基的选择：醋酸菌是革兰氏阴性菌，最适生长温度一般在30-35°C范围内。
常用的筛选培养基包括葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂（GAC）和醋酸葡萄糖琼脂（GAA）。
也可以根据菌种特性选择适宜的培养基进行筛选。
5.培养条件控制：将分离出的菌种接种在含有适宜营养物质的筛选培养基上，并控制培养条件。
包括温度、pH值、搅拌速度等。
优化培养条件可以提高菌种的产量和质量。
6.菌种纯化：逐步单菌分离并培养，目的是获得纯种菌株，确保菌株的纯度和稳定性。
7.菌种特性分析：对分离出的菌种进行鉴定和特性分析，包括形态学观察、生理特性鉴定、生化指标检测和分子生物学方法确定其种属和亲缘关系等。
总结：醋酸菌菌种的分离筛选是一个多步骤的过程，需要进行样品收集、菌落计数、菌种分离、筛选培养基的选择、培养条件控制、菌种纯化以及菌种的特性分析。
通过这些步骤的实施，可以获得高效的醋酸菌菌种，为醋酸菌的应用提供有力的支持。
杏皮渣醋酸发酵醋酸菌的分离筛选和鉴定
杏皮渣醋酸发酵醋酸菌的分离筛选和鉴定吴越;张富县;艾乃吐拉·马合木提;傅力【摘要】[目的]筛选获得适宜杏皮渣醋发酵的醋酸菌并对其进行鉴定,为杏皮渣醋质量及产量的提高奠定基础.[方法]在杏皮渣汁自然发酵液、固态发酵醋醅和杏园的土壤中分离醋酸菌,对分离菌株进行产酸曲线的测定及生理生化鉴定,对产酸量高的菌株进行16S rDNA序列测定并建立系统发育树,对其进行鉴定.[结果]共分离得到6株菌,其中Ac01、Ac02、Cp01、Cp02和Tr01属于醋酸菌属.初步判定,在杏皮渣汁的自然发酵液中分离的Ac01和Ac02可能属于醋化醋杆菌(Acetobacter aceti),菌株Ac02醋酸产量在分离菌株中最高,可达到3.04 g/100 mL,其16S rDNA序列与Acetobacter pomorum strain LMG 18848 16S rDNA序列相似度大于99％.[结论]在杏皮渣汁自然发酵液中分离得到的菌株Ac02为醋杆菌属(Acaobacter)的Acetobacter pomorum strain LMG 18848,是一株在杏皮渣醋生产中有应用潜力的醋酸菌.%[Objective] The aim of this study was to screen and identify the acetic acid bacteria strain for brewing vinegar from apricot dregs and lay the foundation for the improvement of the quality and yield of apricot dregs vinegar.[Method] The acetic acid bacteria were isolated from the natural fermentation broth of apricot dregs juice,the solid fermentative substrate of vinegar and the orchard soil,the curve of acid production was measured and the experiments of biochemical identification of each selected strain were conducted.The strains which could produce the highest acid were identified by 16S rDNA sequence and by the phylogenetic tree.[Result] Six strains wereisolated,Ac01,Ac02,Cp01,Cp02 and Tr01 were identified asAcetobacter.Ac01 and Ac02 separated from the natural fermentation broth of apricot dregs juice may belong to Acetobacter aceti after the preliminary determination,the acetic acid yield of the strain Ac02 can reach 3.04 g/100 mL.The similarity of 16S rDNA sequence is more than 99％between Ac02 and Acetobacter pomorum strain LMG 18848.[Conclusion] The strain Ac02 from the natural fermentation broth of apricot dregs juice was identified as Acetobacter pomorum strain LMG 18848.It is a potential application of acetic acid bacteria in brewing vinegar from apricot dregs.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2013(050)007【总页数】7页(P1297-1303)【关键词】杏皮渣;醋酸菌;分离;16S rDNA;鉴定【作者】吴越;张富县;艾乃吐拉·马合木提;傅力【作者单位】新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学食品科学与药学学院,乌鲁木齐830052;韩山师范学院生物系,广东潮州521041【正文语种】中文【中图分类】S662.2;S188+.40 引言【研究意义】新疆是全国较大的浓缩杏浆生产基地，2011年新疆杏浓缩浆产量已达约4.53×104t。
菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选
摘要：以菠萝皮渣为样品，采用碳酸钙平板培养基分离，通过观察透明圈，革兰氏染色与产醋酸定性试验，筛选出2株优良醋酸菌。
对筛选得到的目的菌株进行产酸定性试验、细菌形态学观察、生理生化鉴定，结果表明为醋酸杆菌属，分别标记为B3和B4。
在32℃下以转速150r/min恒温振荡条件下培养并测定B3和B4产酸量和生长量，结果表明B3，B4在发酵84h时产醋酸量最高，分别为1.12g/L（p<0.05）和1.2g/L（p<0.01）。
对其生长量进行比色法测定，表明B3在培养16h（p<0.05）后进入生长稳定期，B4在培养19h（p<0.01）后进入稳定期。
关键词：菠萝皮渣；醋酸菌；分离；筛选中图分类号：TS264.22文献标志码：A doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2020.11.005（College of Agriculture and Forestry，Longdong University，Qingyang，Gansu745000，China）Isolated acetic acid bacteria with CaCO3-plate in pineapple bran，comparing of the transparent circle，Granmstain and acid qualitative tests to screening2strains which had high acetic acied output.It was proved that the strains were acetic acid by the methods of bacterial morphological observation and biochemistry analysis.The propionic acid output and growth of screened strains marked B3and B4were cultured in32℃150r/min were up to1.12g/L and1.2g/L respectively after culture during of84h.The result of biomass determination indicated that B3and B4were up to stable growth period when the culture during was16h and19h respectively.pineapple residue；acetic acid bacteria；isolation；screen菠萝皮渣中醋酸菌的分离与筛选宋曦，汪慧，王应强，张亚亚（陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000）收稿日期：2020-04-24基金项目：陇东学院青年科技创新项目（XYZK1509）。
新疆酿酒葡萄表皮醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化
新疆酿酒葡萄表皮醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化姜蕾;王斌;肖婧;程卫东;史学伟【摘要】以新疆产区的赤霞珠酿酒葡萄为材料,采用稀释平板法分离得到5株醋酸菌,16S rDNA测序结果表明K1、K-2、K-3属于Acetobacter peroxydans(过氧化醋杆菌),K-4属于Acetobacter oeni(葡萄酒醋酸杆菌),K-5属于Gluconobacter albidus(白葡糖杆菌).选取以上5株醋酸菌进行7天发酵试验,结果表明K-4菌株产酸能力最高.通过单因素试验及正交试验设计对K-4菌株进行产酸培养基优化,结果表明K-4菌株最佳产酸条件为1.5％酵母膏、1.5％葡萄糖、6％无水乙醇.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2019(044)004【总页数】5页(P75-79)【关键词】酿酒葡萄;醋酸菌;产酸特性【作者】姜蕾;王斌;肖婧;程卫东;史学伟【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学信息科学与技术学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】TS261.1新疆地大物博，气候独特，瓜果品种多、种植面积大、糖度极高、品质优良，但由于加工和销路的问题，每年产生大量的废渣和残次果，造成严重的经济损失。
果醋是一种以果蔬或其下脚料为主要原料，通过酒精发酵和醋酸发酵而成的具有多种营养成分和保健功能的液态食品[1,2]。
因此，发展新疆特色果醋能够快速、有效地解决新疆果品加工废渣及残次果经济损失的问题。
醋酸菌种是决定果醋产量和质量的主要因素之一。
目前，果醋酿造的优良菌株分为醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)2个属。
常用的酿造用醋酸菌还有奥尔兰醋杆菌(A. orleanense)、许氏醋杆菌(A. schuegenbachii)、产醋醋酸杆菌(A. acetigenum)、弯曲醋杆菌(A. curvum)、纹膜醋杆菌(A. aceti)、恶臭醋酸杆菌(A. rancens)、攀膜醋杆菌(A. ascendans)、胶膜醋杆菌(A.xylinum)等[3,4]。
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定
苹果醋发酵用醋酸杆菌的筛选与鉴定李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【摘要】近年来,苹果醋逐渐兴起,但是目前用于苹果醋生产的醋酸菌还存在着各种各样的不足,因此有必要进一步筛选产酸性能好、适应苹果醋发酵的醋酸菌.该研究从自然发酵的苹果醋和苹果园土壤中筛选到19株醋酸菌,菌株YT06,YT10,YT12,YT14和YT17的产酸能力较好,在乙醇浓度为6％时产酸量最大,其中菌株YT17在第8天时产酸量达到27.91 g/L;对这5株菌进行分子生物学鉴定,发现按照亲缘关系分属于3个种:桃醋酸杆菌(Acetobacter persici):YT06;苹果醋杆菌(Acetobacter malorum):YT12,YT14;芝庇侬醋杆菌(Acetobacter cibinongensis):YT10,YT17.【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2018(043)010【总页数】5页(P22-25,36)【关键词】醋酸杆菌;苹果醋;筛选;鉴定【作者】李华敏;李林;黄萍萍;刘文丽;潘敏;庄若茹【作者单位】鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;烟台市粮油质量检测中心,山东烟台 265301;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025;鲁东大学食品工程学院,山东烟台 264025【正文语种】中文【中图分类】TS264.22果醋是以水果(包括苹果、葡萄、梨、猕猴桃、柑橘、柿子等)为主要原料，利用酵母菌和醋酸杆菌二次发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，其兼具水果和食醋的营养保健性能，有着巨大的市场潜力[1-3]。
在众多果醋中，苹果醋具有苹果果香，因其富含醋酸、苹果酸、琥珀酸和氨基酸等而使醋的风味独特、酸味适度，同时苹果资源丰富，苹果醋生产工艺简单，使其成为市场占有率最高的果醋产品[4-7]。
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醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。
醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。
可进行分离菌鉴别。
1.培养基：
1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000mlCaCO
310-15g95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入）PH自然
1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L酵母膏10g/L CaCO
315g/LPH 6.8
1.3乙醇30mL/L酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO
310-15g/L（常规筛选培养基）PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。
1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO
315-20g/L琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。
1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH
2PO
40.5g/L MgSO
40.5g/L PH 6.5-6.8
2.菌种筛选：
2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，
130-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。
形态与醋酸菌相符即可分离。
2.2混菌法分离：（分离及初筛）
适度稀释10-5、10-6、10-7取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。
挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃24-48h。
根据菌落周围溶解透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。
2.3性能测定：（复筛）
不同菌落接种于液体曲汁乙醇培养基（30-50ml/250ml）中，30℃震荡培养24-48h。
2.3.1镜检：染色镜检细胞整齐，椭圆或短杆状，革兰氏阴性菌。
2.3.2性能测定：
醋酸定性分析：取发酵液（离心去菌体）5.0ml于洁净试管中，用10℅氢氧化钠中和PH至7.0，加入1℅三氯化铁溶液2-3滴，摇匀，观察溶液是否变黄褐色，加热共沸，形成红褐色沉淀，原液变无色者为产醋酸细菌。
生酸量测定：1.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。
醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx60.06x10-3/样品毫升数x100
2同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。
3。