百合转基因研究进展1

百合转基因研究进展尹丽蓉1,2　谢丙炎13　肖启明2　杨宇红1　葛红1(1中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京　100081;2湖南农业大学,长沙

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)

摘　要:　从百合遗传转化受体的建立和百合转基因体系的建立两方面综述了建立百合的遗传转化体系的研究情况,后者包括抗生素的选用、转化再生植株的筛选、共培养时间、农杆菌菌株的选择。同时对近10年来在百合遗传转化方面所作的研究工作进行了综述,包括转报告基因,转抗病、抗虫和抗病毒基因,以及转化技术的研究。提出了转基因百合存在的问题,并就其前景进行了展望。关键词:　百合　遗传　受体　目的基因　转化技术

AdvancesoftheResearchonTransgenicLilium

YinLirong1,2　XieBingyan13　XiaoQiming2　YangYuhong1　GeHong1(1Instituteofvegetablesandflowers,ChineseAcademyofAgricultural

Sciences,Beijing　100081;2HunanAgriculturalUniversity,Changsha

410128)

Abstract:　TheauthorsummarizedhowtoestablishgenetictransformationsystemsofLiliumwerecomposedofestablishinggenetictransformationacceptorsystemsandestablishingtransgenicsystemsofsomeofliliumculti2vars,thelatterincludedchoiceantibioticsandregenerationplants,co2culturedtime,optimalAgrobacteriumStrainandsoon.Inrecentfewdecades,awiderangeofnewcarefullystudyingandnewreportshavebeendevelopedforva2riousgenetictransformationobjects,reportsgene,resistantdiseases,insectandtransferredtovirusgene,andtrans2formationtechnology.Finallypresentedtoexistquestionsandprospectsabouttransgeniclilium.Keywords:　Lilium　Genetic　Acceptor　Targetgene　Transformationtechnology

百合是多年生球茎类植物,其花具有很高的观赏价值。加强百合育种具有很高的经济效益和社会效益。长期以来其品质的改良都是依赖于传统的遗传育种方法。植物分子生物学的迅速发展,为改良植物品质和性状提供了全新的途径,利用转基因的手段改良百合性状和品质变得切实可行。良好的受体系统是百合基因转化的一个关键技术环节,高效、稳定且再生能力强的植物受体系统的建立是实现基因转化的先决条件。对于百合而言,利用抗病基因、抗虫基因和抗逆基因等外源基因来改良其品质无疑具有重要意义。现就近10年来百合转基因研究现状综述如下。1　遗传转化体系的建立建立良好的基因转化离体再生系统即基因转化的受体系统是植物基因工程的重要前提条件,基因转化受体系统的建立,主要依赖于植物组织培养技术。自1957年Robb离体培养百合鳞茎成功以来,

百合的组织培养技术已取得显著进展。百合的再生能力强,再生方式多样,可通过直接分化、愈伤组织再分化、体细胞发生等途径再生,为百合基因转化受体系统的建立提供了方便。1.1　再生植株途径利用植物组织培养技术进行百合快速繁殖时,

繁殖中间体的诱导一般可通过三条途径:一是器官发生途径,即通过外植体腋芽发育和不定芽的产生,

形成丛生芽块的过程;二是愈伤组织诱导及再分化途径。即外植体首先经诱导形成愈伤组织,然后再经分化形成不定芽的过程;三是胚状体发生途径,即

收稿日期:2005207206

作者简介:尹丽蓉(19802),女,湖南怀化人,植物病理学硕士研究生,从事园艺作物抗病基因工程研究,Email:yinlirong104@yahoo.com.cn

　3通信作者:Email:xieby@mail.caas.net.cn

　生物技术通报・综述与专论・ BIOTECHNOLOGY　BULLETIN 2005年第5期通过外植体直接诱导产生胚状体或先形成愈伤组织,再经愈伤组织形成胚状体的过程。在百合组织培育过程中,这三条途径都存在。愈伤组织再生植物有利于产生新的遗传变异,从中选择抵抗力强的突变体(体细胞的无性系变异),以改良百合品种,提高百合的生活力和生存力。且胚性愈伤组织是基因转化的良好受体材料,有利于外源基因整合到植物基因组中。诱导愈伤组织并较长时期维持其胚性状态对其基因转化有重要意义[1]。百合鳞片、茎尖、叶片、花梗、花托等外植体可直接诱导小鳞茎或不定芽再生植株[1]。百合鳞片切块接种在含不同激素配比的MS培养基上,鳞片基部近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎。外植体也可通过愈伤组织再分化小鳞茎或不定芽再生植株[2～3]。Goto等[4]将百合茎尖接种在含Picloram(1mg/L)的MS培养基上,建立了细胞悬浮培养体系。继代4年后,细胞悬浮培养物仍有较高的不定芽发生能力,再生的植株未发现遗传变异。鳞片、花梗、花丝、雌蕊等外植体诱导的愈伤组织还可通过体细胞胚胎发生途径再生植株[5～6]。Tribulato等[6]培养百合的雌蕊、花托切段获得两种愈伤组织:一种是紧实、易器官分化的;另一种是疏松、器官分化较少的。由后一种愈伤组织建立了细胞悬浮培养,6个月后产生类似胚胎的结构,转移至无激素的固体培养基上,萌发为完整植株。在百合鳞片的切块培养中还发现了直接的体细胞胚胎发生,鳞片经2,42D预培养后,转入无激素的MS培养基上,鳞片表面可直接产生体细胞胚胎[7]。1.2　外植体用于百合快速繁殖的外植体取材十分广泛,从根尖、鳞片叶、鳞片芽、珠芽、叶鞘、花蕾、花梗、雌蕊、花柱、花丝到胚、实生苗都有报道,其中以鳞片居多[3,8]。鳞片切块培养可增加单位鳞片产生的小鳞茎数量。鳞片沿纵轴横切,基部的切块较顶部的切块诱导的小鳞茎数量多,且重量大。近年来花丝、花托等花器官的离体培养也应用于百合的快速繁殖。Arzate等[2]以麝香百合(L.longiflorum)的花丝为外植体,通过诱导愈伤组织再分化再生植株,未发现遗传变异。Nhut等[8]用百合的花梗、花托、花瓣、花柱、子房、雌蕊等外植体进行离体培养,结果花托最易成活,芽诱导率最高,并成功应用于麝香百合和天香百合(L.aurarum)的快速繁殖。Wickremesin2he[3],ArzateFernandez[9]等分别从鳞片、花器等诱

导愈伤组织并获得再生植株。Sundeep等[10]报导:

完全的黑暗对于L.longiflorum愈伤组织的诱导是至关重要的。1.3　培养基和激素百合快速繁殖使用的基本培养基有MS、LS、SH、N6、B5、Hyponex等,其中最常用的是MS培养基。Joung等[11]研究了基本培养基对百合小鳞茎形成的影响,MS培养基较Hyponex培养基诱导的小鳞茎多,且再生植株叶绿素含量较高。Lim等[12]以MS为基本培养基,探讨光照、糖浓度、总盐浓度对百合小鳞茎形成的影响。在16h光照、30g/L蔗糖的条件下,1/2MS促进小鳞茎的数量增加;而在连续黑暗、90g/L蔗糖的条件下,1/4MS则获得最大的鳞茎生长。Tanimoto等[13]研究了多胺对麝香百合鳞片培养的影响,多胺显著促进小鳞茎的诱导,其中效果最好的是精胺。在百合的快速繁殖中,应用的激素有:BA、KT、TDZ、IAA、NAA、IBA、BR、2,42D、Di2camba、Picloram[5～6,14]等。Haensch等[14]将不同基

因型的百合接种在含2,42D或Picloram的MS培养基上,在23个百合杂种中,仅4种获得了体细胞胚胎,2,42D诱导体细胞胚胎的效果要比Picloram好。Han等(1999)认为,高浓度的BA抑制小鳞茎形成,BA配合IAA比单独使用BA诱导小鳞茎的效果好,BA(2mg/L)配IAA(0.1～1.0mg/L)小鳞茎增殖最多。Ohkawa等[14]研究了BR和NAA对鳞片培养的影响,BR(0.1mg/L)诱导的不定芽最多,而BR(0.01mg/L)配合NAA(0.1mg/L)不仅有利于

小鳞茎的诱导,而且有利于小鳞茎的生根。2　百合转基因体系的建立2.1　抗生素的选用在外植体与农杆菌共培养后必须使用抗生素抑制农杆菌,否则由于农杆菌的过度繁殖造成外植体切口处转化细胞的死亡和不定芽诱导困难。通常使用的抗生素有羧苄青霉素,其浓度为250～500mg/

L[15～17];头孢霉素,其浓度为250～500mg/L[15～16,18];潮霉素,其浓度为20～50mg/L[18]。

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期

尹丽蓉等:百合转基因研究进展2.2　转化再生植株的筛选在百合基因转化中最常用的筛选标记基因为NPTII,卡那霉素筛选浓度为100～125mg/L[15～16,18]。2.3　外植体侵染农杆菌菌液后共培养的时间不同百合品种对农杆菌敏感性不一样。百合愈伤组织与农杆菌侵染数分钟[15～18],然后再黑暗共培养2d[16],3d[15],4d[17],甚至7d[18],诱导频率得以提高,说明适当时间的共培养有利于转化效率的提高。2.4　农杆菌菌株的选择不同的百合品种对农杆菌侵染的敏感性不同,

而不同的农杆菌菌株对不同的百合品种的侵染能力也不同(表l)。

表1　百合遗传转化最佳农杆菌菌株品种外植体最佳农杆菌菌株作者,年份NellieWhite鳞茎C58优于EHA101,LBA4404,K12Cohen等[17]1992

Harmony节间C58/pTiC58优于C582C1/pMP90Langeveld等[19]1995

Liliumspp.鳞茎LBA4404刘菊华,等[16]2003

LiliumlongiflorumThunb花丝EHA105唐东芹,等[15]2004

Acapulco花丝EHA101Hoshi等[18]2004

3　百合遗传转化的目的基因3.1　报告基因早期的百合遗传转化有GUS基因、NPTII基因、CAT基因、GFP基因、uidA基因、PAT基因。其目的是建立高效稳定的遗传转化体系,在培养基的选择[4～14,16]、筛选剂种类[15]、筛选剂浓度[15～16]、筛选时间[18]、农杆菌菌株的选择[17,19]、不同的载体[17,19]、共培养的条件[15～19]等获得了许多成果。3.2　抗病基因由于百合的病害十分严重,抗病育种成为近年来百合育种工作的一个新热点。将抗病的相关基因转入栽培品种,从中筛选出既具有优良的观赏价值,又具较强抗性的植株。刘菊华等用携带有几丁质酶基因和β21,3葡聚糖酶基因的工程菌,通过农杆菌介导法和基因枪转化法转化龙牙百合,Southern点杂交检测外源基因整合到染色体上[16]。3.3　抗虫基因在切花百合的栽培中,虫害是影响百合生产的一个重要问题,其中危害较大的虫害主要有蚜虫、红蜘蛛和几种鳞翅目害虫。蚜虫从两个方面危害百合,一是吸取植物汁液造成直接危害,二是传染病毒导致品种退化,对百合生产和品质造成很大的影响。目前在植物抗虫基因工程中,已被广泛应用的抗虫基因有苏云金芽孢杆菌基因,植物外源凝集基因,植物蛋白酶抑制剂基因和淀粉酶抑制剂基因等四类。其中植物外源凝集基因在自然界广泛存在,种类很多,它能特异识别可逆结合糖类复合物的糖基部分而不改变被识别糖基的共价结构,是一类非免疫蛋白。唐东芹等将半夏凝集素基因pBIXPTA通过农杆菌导入百合基因组中,分子检测证明已整合到百合基因组中[15]。3.4　抗病毒基因病毒病也是百合的主要危害之一。早在20世纪初就发现病毒具有交叉保护现象,利用这一原理人们开展了大量的转基因研究工作,为百合病毒病的防治开辟了一条新途。Langeveld等[20]1997年以