农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变

农药多抗性哈茨木霉的常压室温等离子体诱变周文臣;詹晓北;朱莉;郑志永;吴剑荣【摘要】This study aimed to improve the adaptability of biocontrol Trichoderma in the complicated agricultural environment in where herbicides, insecticides, and fungicides co-exist.Trichoderma harzianum was used as initial strain and induced by atmospheric and room temperature plasma(ARTP). The Trichoderma harzianummutants resistant to both fungicides mancozeb and insecticide dinotefuran were obtained and one with the most double-resistance was named as Th-36. The mutant was subject to further mutation by ARTP and screened on the medium with mancozeb, dinotefuran and herbicide oxyfluorfen. Two mutants with triple-resistance were obtained and named as Th-3-36 and Th-4-B. The toxicity resistance test showed that EC50s of mancozeb for Th-3-36 and Th-4-B were up to 5089.2μg a.i.·mL-1 and 5498.2μg a.i.·mL-1;for dinotefuran up to 758.5μg a.i.·mL-1 and 785.9μg a.i.·mL-1;for oxyfluorfen up to 198.2μg a.i.·mL-1 and 200.3μg a.i.·mL-1respectively. The above values were all higher than the average commercially recommended doses of these pesticides. The screened mutants showed the significant increasing resistance to pesticide, inherited parental broad-spectrum antibacterial property, and presented genetic stability. Furthermore growth capacity and enzyme characteristics of the mutants were better than those of the parental strains.%旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂以及杀菌剂共存的复杂环境的适应性,以生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum,GIM3.442)为出发菌株,采用常压室温等离子体的方法对出发菌株进行诱变.结果显示,以杀菌剂代森锰锌和杀虫剂呋虫胺为筛子,选育出对复合农药有良好抗性的诱变菌株.从中挑选双抗性最好的菌株Th-36,以含有杀菌剂代森锰锌、杀虫剂呋虫胺和除草剂乙氧氟草醚的PDA为诱变筛选培养基,再次进行诱变筛选,获得两株具有三抗特性菌株(Th-3-36和Th-4-B).毒力测试表明,抗性菌株Th-3-36和Th-4-B对代森锰锌、呋虫胺和乙氧氟草醚的EC50分别达到5 089.2μg a.i.·mL-1和5 498.2μg a.i.·mL-1、758.5μg a.i.·mL-1和785.9μg a.i.·mL-1、198.2μg a.i.·mL-1和200.3μg a.i.·mL-1,均高于各农药的市售平均推荐使用浓度.筛选到的突变株对农药抗性明显增强、遗传了亲本的广谱抗菌性并具有良好的遗传稳定性,生长繁殖能力和酶学性质优于亲本菌株.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】10页(P214-223)【关键词】常压室温等离子体诱变(ARTP);哈茨木霉;农药抗性;驯化选育【作者】周文臣;詹晓北;朱莉;郑志永;吴剑荣【作者单位】江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室,无锡214122;江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室,无锡214122;江苏瑞光生物科技有限公司,无锡 214125;江苏瑞光生物科技有限公司,无锡 214125;江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室,无锡214122;江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室,无锡214122【正文语种】中文传统化学农药由于操作简单、见效迅速、能快速大规模生产而在农业生产中广泛使用，但其泛滥使用会导致“3R”（抗性Resistance、残留Residue、再猖獗Resurgence）问题和生态环境恶化［1，2］。

生物防治（biological control）是利用天然产物，生物体如细菌、真菌、线虫、昆虫或其代谢产物等对植物病害进行有效防治的技术与方法［3］，而生防制剂（biological control agents，BCAs），即生物杀菌剂是利用天然产物、微生物活体及其代谢产物所生产的、对植物病害起防治作用的制剂。

它不仅可以减少传统农药对环境的危害、在动植物体中的残留，还可以避免病菌对农药产生抗性而导致的农药失效［4］。

典型的生防菌，如木霉菌（Thchoderma spp.），由于其生存范围广泛、拮抗病原菌广谱（至少对18个属，29种病原真菌具有拮抗性）［5，6］，对温度、pH、氧浓度和紫外照射等不利环境条件耐受性强［7］，防病机制多样，低毒且对环境友好，已经应用于许多大田作物和园艺作物的土传真菌病害的防治［8］。

目前全球已经约有50多种木霉制剂在售［9］。

根据最新报道，许多生防木霉菌还能起到改善土壤环境［10］，降解残留农药的作用［11］。

哈茨木霉是目前使用最多的生防木霉菌，可以用于防治如丝核菌、疫霉菌、腐霉菌等植物病原真菌［12］。

早在1981年，哈茨木霉防治李属果栩银叶病（Chondrostereum purpureum）的木霉生防制剂已经在西欧商品化生产［13］，近年来，以色列、美国拜耳公司也推出哈茨木霉生防制剂产品［14］。

但是，在实际农业生产过程中，植物病原菌、杂草、虫害等有害生物共存于农田生态环境之中，某些杀虫剂、除草剂以及其他化学杀菌剂的使用和残留会对生防木霉的生长、产孢量产生不良的影响，也导致木霉生防作用下降，限制了其田间单独使用的效果和范围。

因此，生防木霉菌与农药的关系［15］，通过诱变育种、原生质体融合、遗传改造等手段改良野生生防菌的特性［16-18］、提高其耐药性和与其他杀菌剂的混用［19-22］，已经引起人们的兴趣与重视。

但是，目前的研究多集中在生防菌对杀菌剂的抗性提高，有关木霉菌对除草剂和杀虫剂的抗性提高的报道很少，还未有对除草剂和杀虫剂抗性菌株的选育的报道。

由清华大学开发的常压室温等离子体诱变系统（ARTP）能够在大气压下产生温度在25-40℃之间、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流，改变细胞膜或者细胞壁通透性、DNA和蛋白质等大分子结构，造成基因损伤从而引起微生物发生突变［23］。

近年来，该项突变技术已经被成功应用于突变细菌、微藻、酵母等微生物［24-26］。

生防木霉菌对农药的敏感性与细胞骨架的重要组成成分微管有关，微管的主要成分为微管蛋白，微管蛋白和农药的亲和力下降，造成真菌耐药［27］。

ARTP对蛋白质等大分子的结构影响以及前人应用该项技术突变微生物的成功案例使得ARTP在改造生防菌耐药性能方面潜力巨大，但目前为止还未见到有应用此项技术改良生防木霉菌性能的报道。

本研究以哈茨木霉（Trichoderma harzianum GIM 3.44）为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变（ARTP）和含复合农药培养基相结合的方法筛选对农药有交叉抗性的生防木霉菌，挑选出两株对杀虫剂呋虫胺、除草剂乙氧氟草醚和杀菌剂代森锰锌具有综合抗性的抗药性菌株，并检测其各项生理指标，旨在为提高生防木霉菌对田间除草剂、杀虫剂及杀菌剂共存的复杂环境适应性提供参考。

1.1 材料1.1.1 菌种哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）GIM 3.442，购于中国广东省微生物菌种保藏中心。

棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. Sp）ACCC 36882、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）ACCC 36211、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）ACCC 36908，购于中国农业科学院植物保护研究所。

马铃薯早疫病菌（Alternaria solani），由江南大学生化工程与生物反应器实验室活化并保藏。

1.1.2 培养基保藏和孢子制备：马铃薯综合培养基（PDA）（g/L）：马铃薯汁200，葡萄糖20，KH2PO43，MgSO4·7H2O 1.5，硫胺素0.008，琼脂20，pH6.0，于121℃灭菌20 min。

含药PDA培养基的制备：先把农药用无菌水配制成母液，再用灭菌水稀释成一定倍数，添加到40-50℃的综合PDA培养基中。

液体培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母浸粉 15，（NH4）2SO42.5，KH2PO46.0，MgSO4·7H2O 0.8，pH6.0，25℃。

1.1.3 试剂除草剂：果儿（乙氧氟草醚23.5%乳油），上海惠光有限公司；锄当家（30%草甘膦水型），深圳诺普信农化有限公司；盖能草（高效氟吡甲禾灵，108 g/L乳油），美国陶氏益农。

杀菌剂：75%百菌清可湿性粉剂，利民化工股份有限公司；80%代森锰锌可湿性粉剂，印度联合磷化有限公司；99%噁霉灵可湿性粉剂，山东天达股份有限公司。