原生质体培养
植物原生质体培养
第六章：植物原生质体培养请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。
）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。
2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。
有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。
经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。
“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。
此外，太空环境还是一个微重力环境。
中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。
这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。
自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。
但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。
因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。
细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。
而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。
6.1 原生质体的概念和研究进展6.1.1原生质体的概念原生质体(protoplast)：我们把除去细胞壁、裸露的、有生活力的原生质团或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，称为原生质体。
修改第八章原生质体培养和融合
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使用的酶主要有： 纤维素酶(Cellulase)、 果胶酶(Pectolyase)、 离析酶(Macerozyme )、 半纤维素酶(Hemicellulase) 崩溃酶(Driselase)， 其中纤维素酶和果胶酶是最必要的。
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酶液中的渗透压是原生体分离的另一个因素，植物细 胞去壁后，必须由合适的渗透压替代细胞壁维持的机械压力， 酶液中的渗透压过低会使细胞吸涨而破裂；渗透压过高，细 胞除受到渗透压力而破裂外，还会损害细胞生长代谢 。
培养基，将适当密度的原生质体悬浮液加在含琼脂的培养基上。 液层较浅，有利于通气，而且固体培养基中的养分可以释放到 液层中去，以补充培养物对养分的消耗。另外培养物中的代谢 产物对原生质体的生长不利，可以为固体层所吸收，降低或消 除毒害。
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13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
原生质体纯化(以柑桔原生质体为例，界面法)
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果胶酶和 纤维素酶
过滤、离心
原生质体制备流程（以叶片为例）图
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第二节 原生质体的培养
一、原生质体培养的方法 1. 液体培养
培养基中不加凝固剂，仅仅用液体培养基按所需植板密度重悬 原生质体后，直接植板在培养皿中即可。 液体浅层培养法是目前 原生质体培养中广泛应用的方法之一。 优点：操作简便，对原生质体伤害小，有利于通气。 缺点：容易使原生质体互相粘连、聚集，导致原生质体损坏；并且 难于定点观察监测单个原生质体的发育过程。
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***沉降法：利用密度不同沉降速率不同的原理，低速离心使 原生质体沉于离心管底。此法方便，但不易除尽一些完整的 细胞或破碎的原生质体。 ***界面法利用原生质体和破碎细胞比重不同，低速离心条件 下完整的原生质体漂浮于密度不同的两相分界处，碎片留在 低层相中，可从两相界面收集到高纯度原生质体。
原生质体无菌分离培养与融合
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
遗传学ppt课件第4章 原生质体培养及融合配色
缺点：由于高渗溶液对原生质体有伤害， 因而活力高的原生质体较少。
B、离心沉淀法
酶解产物 +原生质 体培养基
0.45mol/L甘露醇 400g，5min
碎片带
原生体
利用比重差别原理，在甘露醇溶液中低速离心，使原生质体沉积在试管底部，然 后再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体的游离（分离）与纯化 1）原生质体的游离
经酶液处理后，细胞壁被降解，释 放出球状原生质体。为使原生质体从组 织上解离下来，酶解的最后2小时需轻 度振荡，速度为45转/分（rpm）。
酶解液
酶解后的产物包括：
完整原生质体
破碎的原生质体、未去壁的细胞（团）、细胞器及碎片 酶及其它不利于原生质体培养的试剂。
五、原生质体培养 培养密度很重要（原因）：一般以
104-105个/ml为宜。 一般采用的培养方法：液体培养基
→ 固体增殖培养基 → 再分化培养基 → 器官、胚胎或植株分化。
培养方式详见第二节。
1）液体培养
分成三个阶段
➢ 培养基Ⅰ：1/2无机盐、正常有机成分、适量的水 解酪蛋白、适量的激素、1% 蔗糖、0.4-0.6 M甘露 醇，pH 5.8
第四章 原生质体培养及融合
名词术语：
➢ 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是 一个被质膜所包围的裸露细胞。
➢ 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程 中，有时会引起细胞中内含物的丢失而形成一些 较小的原生质体，称为亚原生质体。 它可以具有细胞核，也可以没有细胞核，或是 只有1条或少数几条染色体，具体情况有：
一词。 ➢ 1892年，Klercker采用机械法分离原生质体，但效
植物原生质体培养的技术流程
植物原生质体培养的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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原生质体培养方法和再生植株的遗传与变异
压，否则细胞团不会继续生长。待 小愈伤组织长至1 -2mm时，应及时
转移至固体培养基使其进一步生长
4.植株再生
原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗 （器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再 诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同
供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其 生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细 胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性
柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤 组织来源的原生质体才能再生
起始培养密度与培养基
–起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml –培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 –培养基营养成分完全性：越丰富越好
仙客来原生质体的再生
香蕉原生质体再生—Assani等2006 看护培养
Sugarbeet （糖 甜菜）callus and protoplast regeneration
影响原生质体培养的主要因素
基因型
– 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组 织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传 分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性 基因控制(Cheng等1991)
• 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的 变异有关
• 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和 品种改良提供有益的材料
• 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细
胞突变育种）
原生质体培养的方法
原生质体培养的方法
哇塞，原生质体培养可是一项超级重要的生物技术呢！它就像是打开生命奥秘大门的一把神奇钥匙。
那原生质体培养到底是怎么做的呢？首先要准备好材料，比如植物的细胞或者微生物什么的。
然后就是关键的步骤啦！要把细胞壁去掉，这可不容易哦，得非常小心才行。
就像拆礼物一样，得轻手轻脚的，不然就会把里面的“宝贝”弄坏啦。
去掉细胞壁后，把这些原生质体放在合适的培养基里，让它们能好好生长。
这里要注意培养基的成分和环境条件都得严格控制好，温度啊、湿度啊都不能马虎。
还要注意无菌操作，可不能让杂菌跑进去捣乱呀！
在这个过程中，安全性和稳定性可是至关重要的呀！就像走钢丝一样，得稳稳当当的。
如果不小心出了岔子，那可就前功尽弃啦。
所以整个操作都要非常严谨，不能有丝毫的马虎。
而且要随时观察原生质体的状态，稍有不对就得赶紧调整。
原生质体培养的应用场景那可多了去啦！比如说可以用来进行基因工程，就像给植物或者微生物来个大变身，让它们拥有更厉害的本领。
还可以用来进行新品种的培育，这多牛啊！它的优势也是显而易见的呀，能够更直接地对细胞进行操作，效率更高。
就拿植物新品种培育来说吧，通过原生质体培养，成功培育出了好多抗病虫害、产量高的优良品种呢！农民伯伯们种上这些品种，那可真是大丰收啊，一个个都笑得合不拢嘴。
这就是原生质体培养的实际应用效果，实实在在地给人们带来了好处呀！
原生质体培养真的是一项超级厉害的技术呀！它为我们打开了无数的可能，让我们能够更好地探索生命的奥秘，为人类的发展做出巨大的贡献。
我相信，在未来，它一定会发挥更大的作用，让我们的生活变得更加美好！。
原生质体培养及融合
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
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A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
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五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
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1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
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4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
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胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
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细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
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原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
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原生质体培养
第三章原生质体培养
1、概念：
原生质体：指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。
植板率：即形成愈伤组织的原生质体数量占所培养原生质体总数的百分比。
体细胞杂交及其表示方法，
对称融合，指亲本原生质体在融合前未进行任何处理（辐射、碘乙酰胺等）的一种融合方式。
非对称融合：指在融合前，对一方原生质体进行射线照射处理，以钝化其细胞核，另一方原生质体不处理或经化学试剂处理，前者为供体，后者为受体。
2、原生质体在研究中有何用途?
（1）用作细胞杂交服务于作物改良（2）用作遗传转化的对象（3）研究细胞壁的发生过程。
（4）筛选突变体。
（5）膜的结构、运输、激素接受位点等的研究。
6）用于分离细胞器和大分子。
7）种质资源保存。
3、分离原生质体的主要来源是什么？分离原生质体主要酶制剂有哪些？
机械法分离酶法分离（在短时间内获得大量原生质体）
纤维素酶降解构成细胞壁的纤维素浓度1%--3%
果胶酶降解连接细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开。
0.1%--1% 半纤维素酶离析酶
4、通常用FDA测定原生质体活力，其原理是什么？
FDA是荧光素双醋酸脂，常用丙酮配制成2mg/ml溶液，在冰箱（4C）中保存。
FDA 本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累。
在活细胞中，FDA经酯酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累。
在紫外光照射下，发出绿色荧光。
相反如果是死细胞，则不会发出绿色荧光。
5、影响原生质体分裂的因素有哪些？
外植体来源酶液组成和浓度渗透压分离培养基培养条件（酶处理时的温度和pH）组织前处理
6、诱导细胞融合的主要方式有哪些？
1、自发融合指酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体彼此融合形成同核体。
2、诱发融合包括NaNO3 高pH-高钙法水溶性多聚体（PEG）法电融合法
7、试述原生质体融合的意义或在育种和遗传研究中的应用。
1）克服有性杂交不亲和性和生殖障碍
2、转移有利的农艺性状，创造新的种质材料
3、转移胞质基因，为研究体细胞遗传提供途径和材料。
8、采用哪些方法对体细胞杂种进行筛选和鉴定？
（1）筛选====
机械选择法（主要利用融合亲本的物理特性差异进行筛选）
互补选择法（根据融合双亲原生质体及同源融合体和杂种细胞对培养基中外源激素需求性的差异，淘汰双亲原生质体和同源融合体，保留杂种细胞以达到选择的目的）包括营养缺陷型白化突变体和用途隐性非等位基因抗生素的抗性互补差异筛选法（2）鉴定=== 形态鉴定株型叶形花器官等
细胞学染色体计数染色体数目是双亲之和，或至少1至几条染色体。
倍性分析粗略地分析杂种细胞的倍性，与双亲对照，侧DNA含量是否是双亲之和。
遗传标记分子标记鉴定是最有效的手段，尤其是细胞学无法确定是杂种的时候。
能检测出遗传物质的细小重组。
染色体原位杂交技术------荧光原位杂交（FISH）鉴定主要检测是否是杂种，鉴定异源染色体的重组情况，将重组片段定位在染色体上。
组分I蛋白-----蛋白质电泳（GISH）分析从基因表达产物判断真假杂种，一般应有双亲作对照，可以对多种蛋白作分析。