冰冻切片的HE染色
《吉林大学HE染色》PPT课件
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冲洗和保存
▪经过长时间福尔马林固定和保存的组织要充分水 洗，否则影响核的染色。
▪一般置于70~80%酒精中40C保存。当酒精混浊时， 更换新的酒精。
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固定易出现的问题与主要原因
扭曲变形与过度硬脆 容器过小；标本数量过多；固定时间过长。 取材过于薄小，尤其疏松结缔组织。 表层过度，中间没有固定透 取材过厚过大；固定时间不足；固定液失效。 固定液浓度高、渗透力强，表面快速硬化。 局部固定不佳 组织与组织重叠；组织与容器接触；组织露出液面。
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注 意 事 项 及 影响 固 定 的 因 素
1. 组 织 块 不 宜 过 大 ， 一 般 以 厚 度 5毫 米 ， 长 宽 不 超 过 15x15毫 米 。
2. 固 定 液 的 量 一 般 以 组 织 块 大 小 的 20倍 为 宜
3. 必 须 选 择 渗 透 力 强 ， 又 不 使 组 织 过 度 收 缩 或 膨 胀 的 试 剂做固定剂.
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特殊的组织或者器官 血液、骨髓：涂片 肌肉、神经： 骨、牙齿：脱钙 切片
酸 8
固定的方法
1. 蒸 气 固 定 法 比 较 细 小 而 薄 的 标 本 ， 可 用 饿 酸 或 甲 醛 蒸 气 固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织等的固。如
血液 涂 片 ， 则 应 在 血 片 未 干 燥 前 就 与 饿 酸 蒸 气 接 触 2注 射 、 灌 注 固 定 法. 某 些 组 织 块 由 于 体 积 过 大 或 固 定 掖 极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。 如 肺 可 将 固 定 液 从 气 管 或 支 气 管 注 入 .全 身 灌 注 固 定 较 大 动 物如
HE染色资料介绍
普通染色又称常规染色或HE（Haematoxylin and eosin）染色。
它是病理技术中最常用的一种方法，通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法，以达到准确，完整的病理诊断。
一、染色目的病理学的所有切片，都必须通过一种以上的染料，通过各种不同的方法，将切片中各种不同的物质，在不同染液的作用下，将其显示出来，使之在光学显微镜下，能够完全的观看各种结构。
例如，HE染色，好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构，细胞核着蓝黑色，细胞浆着粉红色，软骨着蓝色等。
清晰的结构为诊断提供可靠的依据，因此，染色技术也是病理技术中的重要组成部分，必须不断地总结，方能提高。
如果染色不好，切片染色一团糟，红蓝不分，结构不清，层次不明，影响了镜下的观察，直接影响了临床诊断，染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。
二、染色的作用1．化学作用：所有的染色液中，可把它们分为两种类型，一种为酸性，另一种为碱性。
酸性染料中有染色作用的为阴离子，碱性染料中有染色作用的为阳离子，每个细胞也存在着两种物质，细胞核含的是酸性物质，细胞浆含的是碱性物质。
在染色时，细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用，细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用，由于反应的部位不同，结果着色有异。
2．物理作用：在染色过程中，染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内，此时，因受分子的引力作用，色素微粒子被吸附而着色。
由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可显出来不同的颜色来。
一般来说，染色的学说还有许多，但说服力强的仅有上述两种。
但不管怎么样解释，实际上完成的每一种染色，都与上述两种学说分不开，它们的作用是相辅相成，同时存在的。
三、染色方法及步骤1．人工苏木素-伊红染色法（HE法）(1)切片浸入二甲苯中5-10min；(2)切片浸入二甲苯中5-10min；(3)100%酒精1min。
(4)100%酒精1min。
(5)95%酒精1min。
组织化学技术
组织化学技术切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态，以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化。
一、染色的目的任何冰冻切片、石蜡切片等如果不经过染色，在显微镜下只能看到细胞及其它组织成分的轮廓，即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能观察到一些组织结构，但也是极其简单有限的，远不能满足观察和借以诊断的目的。
染色的目的，是将染料配制成溶液，将组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，使组织或细胞及其他异常的成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，便于在光学显微镜下进行观察。
因此，染色在组织形态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工作中，都具有非常重要的意义和实用价值。
二、染色的原理染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程。
有关两者结合的原理，有不同的学说，一般认为其过程是化学反应和物理现象。
（一）染色的化学反应在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别，酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合，碱性物质部分能与溶液中的阴离子结合。
在细胞核中，特别是核内染色质，一般有酸性物质组成（其中主要有核酸），故与碱性染料的亲和力很强，易于染色，以氧化苏木素代表的碱性染料中有染色作用的是阳离子。
在细胞浆中则由碱性物质组成，所以胞浆与酸性染料有较强的亲和力，以伊红染料为代表的酸性染料中有染色作用的是阴离子。
(二) 染色的物理作用1. 毛细作用及渗透作用组织有许多小孔，染料因渗透作用进入组织，它与组织没有牢固的结合，所以是单纯的物理作用，不能称为直接染色作用。
因所谓染色必需是染料留贮于组织内与组织有较稳固的结合。
2. 吸收或溶液作用组织吸收染料，作牢固的结合，组织的着色与溶液颜色相同，但不是和干燥染料的颜色相同。
如复红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的复红带绿色。
3. 吸附作用吸附作用是固体物理的特性，它能从周围溶液中吸住一些细小的物质微粒，这些微粒可能是溶于溶液中的化合物，也可能是只在溶液中单独存在的离子，如染液中分散的色素粒子进入被染物质的间隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。
he染色——精选推荐
一、HE染色石蜡切片制作的基本过程作者：未知来源：生物秀时间：2007-12-71、取材与固定：?从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
2、脱水透明：一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。
再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。
3、浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。
待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。
冷却凝固成块即成。
包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。
4、切片与贴片：?将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。
切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。
5、脱蜡染色：?常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。
苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。
伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。
染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。
HE染色过程是：?①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。
?②酸水及氨水中分色，各数秒钟。
?③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。
?④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。
?⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。
6、脱水透明：?染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。
7、封固：?将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。
待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用。
冰冻切片制作及染色过程中常见问题及处理
举例：不同实验时间和条件下同种一染 色方法结果差异
A
B
C
Masson staining
2. 标本固定应充分
• 固定的标准
– 切片冰晶少，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰
• 一般较多采用组织固定后再行切片 • 浸入法和灌注法
– 浸入法：活检、手术标本，不能进行灌注的组织固定 – 灌注法：动物实验研究
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
(1)所染的全部切片均为阴性结
果，包括阳性对照在内。 染
色
(2)所有切片均呈阳性反应
失
败
(3)所有切片背景过深
(4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应
(1) 所有切片呈阴性
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
• 好的切片制作和染色成功的关键
– 细节决定成败
• 固定、漂洗溶液PH值，成分；切片厚度、手感；抗体效价、特 异性；切片孵育时间，湿度、温度；
• 切片判读正确-反映真实的科学现象
• 知识结构背景
脱钙骨经冰冻切片后进行HE染色的体会
脱钙骨经冰冻切片后进行HE染色的体会
雷安富
【期刊名称】《四川解剖学杂志》
【年(卷),期】1995(3)2
【摘要】脱钙骨经冰冻切片后进行ＨＥ染色的体会雷安富第三军医大学重庆６３００３８骨标本的制作分不脱钙的磨片和经脱钙后再行火棉胶或石蜡包埋切片。
由于脱钙骨用火棉胶或石蜡包埋切片周期长，所用试剂多。
所以，我们改用冰冻切片后进行ＨＥ染色，取得满意效果。
方法：取狗股骨...
【总页数】1页(P118)
【作者】雷安富
【作者单位】第三军医大学，重庆630038
【正文语种】中文
【中图分类】R329－33
【相关文献】
1.不同冻存法对肌肉冰冻切片后HE染色和肌球蛋白ATP酶染色效果的影响 [J], 何茂章;张震;伍仲平;李完波;麻骏武;段艳宇
2.HE染色切片褪色后再进行免疫组化染色方法的比较 [J], 李丽;杨桂芳
3.提高冰冻切片及HE染色质量的应用体会 [J], 熊正文;李春光;丁华野;田玉旺;;;
4.冰冻切片技术在胃癌患者HE染色中的应用效果及影响因素分析 [J], 刘文博; 柳雨; 杨喆
5.术中冰冻切片快速免疫组化HE染色技术诊断硬化性肺细胞瘤和肺腺癌的应用对比 [J], 沈元龙; 李琳; 吴子豪
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冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
HE染色
he染色目录1HE染色介绍2染色分类3染色结果4常规HE染色步骤1 4.1 试剂配置1 4.2 染色流程1HE染色介绍苏木精—伊红染色法( hematoxylin-eosin staining ) ，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
2染色分类易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。
组织内的蛋白质构成蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。
在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。
而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。
如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。
所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。
脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。
苏木精在碱性溶液中称蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
伊红是细胞浆的良好染料。
由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。
经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。
HE染色
技术流程
组织检查
Gross specimen examination
固定 Fixation 包埋 Embedding 染色 Stianing
取材 Cutti
组织检查
Gross specimen examination
容器：广口容器 对组织的要求：The faster you can get the tissue and fix
it, the better. 组织体积适当。
固定时间：0.2cm厚的组织需12小时左右。
取材 Cutting
将组织进一步修、切成2~3mm厚、大小适当 的组织块。放进组织包埋盒。在正常与病变交 界处取材。
注意：
将染液表面析出的金属膜捞去
切片在染液中不要晃动 染色时间5-10分钟，具体时间根据效果决定 染液发红色要重新配
B. 1%盐酸酒精（70% ）分化
将胞核以外部分的蓝色去掉，在镜下控制。 C. 蓝化：自来水流水冲洗30分钟 D. 伊红（署红）染胞浆 Eosin is an acidic dye with an affinity for cytoplasmic components of the cell.
Glutaraldehyde（戊二醛） causes deformation of alphahelix structure in proteins so is not good for immunoperoxidase staining. However, it fixes very quickly so is good for electron microscopy. It penetrates very poorly, but gives best overall cytoplasmic and nuclear detail. The standard solution is a 2% buffered glutaraldehyde. The glutaraldehyde must be cold and buffered and not more than 3 months old.
HE染色步骤
常规HE染色步骤（1）二甲苯（Ⅰ）5-10 min(2) 二甲苯（Ⅱ）5-10 min(3) 95%乙醇（Ⅰ）1-3 min （4）95%乙醇（Ⅱ）1-3 min （5）80%乙醇 1 min （6）蒸馏水 1 min （7）苏木精液染色5-15 min(8 ) 流水稍洗去苏木精液1-3 s(9) 1%盐酸乙醇1-3 s(10) 稍水洗10-30 s(11)促蓝液返蓝10-30 s(12) 流水冲洗10-15 min （13）蒸馏水过洗1-2 s(14) 0.5%曙红液染色1-3 min(15) 蒸馏水稍洗1-2 s(16) 80%乙醇稍洗1-2 s(17) 95%乙醇（Ⅰ）3-5min(18) 95%乙醇（Ⅱ）3-5 min(19) 无水乙醇5-10 min(20) 无水乙醇5-10 min(21) 二甲苯（Ⅰ）3-5 min(22) 二甲苯（Ⅱ）2-5 min(23) 二甲苯（Ⅲ）3-5 min(24) 中性树胶封固结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。
一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。
小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
二、冰冻切片时的注意事项：①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。
有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。
因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
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