反胶团萃取

四、双水相萃取
双水相萃取(Aqueous two-phase extraction)是利用物质 在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现分离的 方法。1955年由Albertson首先提出了双水相萃取的概念, 此后这项技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆 流层析、反应分离耦合等方面都取得了一定的进展。到 目前为止,双水相技术几乎在所有的生物物质如氨基酸、 多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等的分 离纯化中得到应用,特别是成功地应用在蛋白质的大规模 分离中。
1、反胶团形成过程及其特性 、 从胶体化学可知,向水溶液中加入表面活性剂,当表面活性 剂的浓度超过一定值时,就会形成胶体或胶团,它是表面活性剂 的聚集体。在这种聚集体中,表面活性剂的极性头向外,即向水 溶液,而非极性尾向内。当向非极性溶剂中加入表面活性剂时, 如果表面活性剂的浓度超过一定值,也会在溶剂内形成表面活性 剂的聚集体,称这种聚集团为反胶团。在这种聚集体中，表面活 性剂的憎水的非极性尾向外,与在水相中所形成的胶团反向。 下图为几种可能的表面活性剂聚集体的构型。从图中可看 出。在反胶团中有一个极性核心,它包括了表面活性剂的极性头 所组成的内表面、抗衡离子和水,被形象地称为“水池”。由于 极性分子可以溶解在 “水池”中,也因此可溶解在非极性的溶 剂之中。
利用中空纤维膜组件可以进行生物分子的反胶团萃 取。中空纤维膜材料多为聚丙烯等疏水材料,孔径在微米 级,以保证生物分子和含有生物分子的反胶团的较大通量。 反胶团膜萃取技术的优点是: ① 水相和有机相分别通过膜组件的壳程和管程流动, , 从而保证两相有很高的接触比表面积; ② 膜起相分离器和相接触器的作用,从而在连续操作 的条件下可防止液泛等发生; ③ 提高萃取速度及规模放大容易。
双水相分配技术作为一个很有发展前途的分离单元, 除了具有上述独特的优点外,也有一些不足之处,如易乳化、 相分离时间长、成相聚合物的成本较高、分离效率不高等, 一定程度上限制了双水相分配技术的工业化推广和应用。 如何克服这些困难,已成为国内外学者关注的焦点,其中 “集成化”概念的引人给双水相分配技术注入了新的生命 力,双水相分配技术与其他相关的生化分离技术进行有效 组合,实现了不同技术间的相互渗透,相互融合,充分体现了 集成化的优势。例如：
2、反胶团中生物分子的溶解 、 由于反胶团内存在微水池这一亲水微环境,可溶解氨基酸、肽和蛋 白质等生物分子。因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物 分子的分离纯化,特别是蛋白质类生物大分子。对于蛋白质的溶解方式, 已先后提出了四种模型,见图。图(a)为水壳模型;(b)为蛋白质中的疏水 部 分直接与有机相接触;(c)为蛋白质被吸附在胶团的内壁上;(d)为蛋白 质的疏水区与被几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生作用,并被反胶团 所溶解。上述四种模型中,现在被多数人所接受的是水壳模型,尤其对 于亲水性蛋白质。因为弹性光散射等许多实验研究均间接地证明了水 壳模型的正确性。由图可知,在水壳模型中,蛋白质居于“水池”的中 心,而此水 壳层则保护了蛋白质,使它的生物活性不会改变。 生物分子溶解于反胶团相的主要推动力是表面活性剂与蛋白质的 静电相互作用。反胶团与生物分子间的空间阻碍作用和疏水性相互作 用对生物分子的溶解度也有重要影响。
三、反胶团萃取
反胶团萃取(Reversed micellar extraction)的分离原理 是表面活性剂在非极性的有机相中超过临界胶团浓度而 聚集形成反胶团,在有机相内形成分散的亲水微环境。许 多生物分子如蛋白质是亲水憎油的,一般仅微溶于有机溶 剂,而且如果使蛋白质直接与有机溶剂相接触,往往会导致 蛋白质 的变性失活,因此萃取过程中所用的溶剂必须既能 溶解蛋白质又能与水分层,同时不破坏蛋白质的生物活性。 反胶团萃取技术正是适应上述需要而出现的。
(1)、与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、 气溶胶技术等实现集成化,改善了双水相分配技术中诸如 成相聚合物回收困难、相分离时间较长、易乳化等问题, 为双水相分配技术的进一步成熟、完善并走向工业化奠 定了基础。 (2)、与亲和沉淀、高效层析等新型生化分离技术实 现过程集成,充分融合了双方的优势,既提高了分离效率,又 简化了分离流程。 (3)、在生物转化、化学渗透释放和电泳等中引入双 水相分配,给已有的技术赋予了新的内涵,为新分离过程的 诞生提供了新的思路。
条件温和。 ③ 条件温和。由于双水相的界面张力大大低于有机 溶剂与水相之间的界面张力,整个操作过程可以在室温下 进行,因而有助于保持生物活性和强化相际传质。既可以 直接在双水相系统中进行生物转化以消除产物抑制,又有 利于实现反应与分离技术的耦合。 ④ 步骤简便。大量液体杂质能够与所有固体物质同 步骤简便。 时除去,与其他常用的固液分离方法相比,双水相分配技术 可以省去1~2个分离步骤,使整个分离过程更为经济。 变通性强。 ⑤ 变通性强。由于双水相系统受影响的因素复杂,从 某种意义上说可以采取多种手段来提高选择性或收率。
大量的研究工作已经证明了反胶团萃取法提取蛋白质 的可行性与优越 性。不管是自然细胞还是基因工程细胞中 的产物都能被分离出来;不仅发酵滤液和浓缩物可通过反胶 团萃取进行处理,就是发酵清液也可同样进行加工。不仅是 蛋白质和酶都能被提取,还有核酸、氨基酸和多肽也可顺利 地溶于反胶团。然而反胶团萃取在真正实用之前还有许多 有待于研究和解决的问题,例如表面活性剂对产品的沾染、 工业规模所需的基础数据;反胶团萃取过程的模拟和放大技 术等。尽管如此,用反胶团萃取法大规模提取蛋白质由 于 具有成本低、溶剂可循环使用、萃取和反萃取率都很高等 优点,正越来越多地为各国科技界和工业界所研究和开发。
此外,某些聚合物的溶液在与某些无机盐等低相对分 子量化合物的溶液相混时,只要浓度达到一定值,也会产生 两相。这就是聚合物-低相对分子量化合物双水相体系。 最为常用的聚合物-低相对分子量化合物体系为PEG/磷酸 钾、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠、PEG/葡萄糖等。上相富 含PEG,下相富含无机盐或葡萄糖。 与一般的水一有机溶剂体系相比较,双水相体系中两 相的性质差别(如密度和折射率等)较小。由于折射率的差 别甚小,有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界 面张力也很小,仅为10-5~10-4N/m(一般体系为10-3~2×102N/m)。
2、双水相萃取的特点及其应用 、 双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备,并在温 和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和纯度的新 型分离技术。与一些传统的分离方法相比,双水相萃取技 术具有以下明显的优点： ① 易于放大。Albertson证明分配系数仅与分离体积 易于放大。 有关,各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低, 这是 其他过程无法比拟的。这一点对于工业应用尤为有利。 分离迅速。 ② 分离迅速。双水相系统(特别是聚合物/无机盐系 统)分相时间短,传质过程和平衡过程速度均很快,因此相对 于某些分离过程来说,能耗较低,而且可以实现快速分离。
3、反胶团萃取过程及其应用 、 用反胶团技术萃取蛋白质时,用以形成反胶团的表面 活性剂起着关键作用。现在多数研究者采用AOT为表面 活性剂。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠或丁二酸 二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT)。溶剂则常用异辛烷 (2,2,4二甲基戊烷)。AOT作为反胶团的表面活性剂是由于它具 有两个优点:一是所形成的反胶团的含水量较大,非极性溶 剂中水浓度与表面活性剂浓度之比可达50~60;另一点是 AOT形成反胶团时,不需要助表面活性剂。AOT的不足之 处是不能萃取分子量较大的蛋白质,且沾染产品。如何进 一步选择与合成性能更为优良的表 面活性剂将是今后应 用研究的一个重要方面。
二、吸附
吸附操作是指流体与某种固体相接触时,固体 能够有选择地将流体中的某些组分凝聚在其表面 上,从而达到分离的目的。这些有吸附作用的固体 称为吸附剂,在固体表面上被吸附的物质称为吸附 质或吸附物。 在吸附过程,气体或液体中的分子、原子或离 子传递到吸附剂固体的内外表面,依靠键或微弱的 分子间力吸着于固体上。解吸是吸附的逆过程。
1、双水相体系和双水相萃取 、 一些天然的或合成的水溶性聚合物水溶液,当它们与 第二种水溶性聚合物相混时,只要聚合物浓度高于一定值, 就可能产生相的分离,形成双水相体系。双水相体系的主 要成因是聚合物之间的不相容性,即聚合物分子的空间阻 碍作用使相互间无法渗透,从而在一定条件下分为两相。 一般认为,只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异,混合 时就可发生相分离,并且水溶性差别越大,相分离倾向也就 越大。聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran,DEX),聚乙二醇/聚 乙烯醇,聚乙烯醇/甲基纤维素,聚丙二醇/葡聚糖，聚丙二 醇/甲氧基聚乙二醇等均为双聚合物的双水相系统。
初期的双水相萃取过程仍以间歇操作为主。 近年来,在天冬酶、乳酸脱氢酶、富马酸酶与青霉 素酰化酶等多种产品的双水相萃取过程中均采用 了连续操作,有的还实现了计算机过程控制。这不 仅对提高生产能力,实现全过程连续操作和自动控 制,保证得到高活性和质量均一的产品具有重要意 义, 而且也标志着双水相萃取技术在工业生产的 应用正日趋成熟和完善。
吸附操作是一种古老的技术。人们发现早在两千多 年前西汉古墓中就用木炭吸湿防潮，这说明当时已了解 到木炭有很强的吸湿作用。20世纪50年代前，因吸附剂 种类少，常用的只有酸性白土、硅藻土和活性炭等几种， 选择吸附的能力低，只限于脱色、脱臭、吸湿、干燥等 小型的操作过程。20世纪60年代以来，随着性能优良的 吸附剂的不断开发(如合成沸石、活性氧化铝、分子筛等) 以及各行各业分离要求的不断提高，使吸附分离技术得 到了迅速发展，成为完整的单元操作过程。目前，吸附 分离技术已经在轻工、炼油、化工、食品、环保等许多 领域得到了广泛的应用。
胶团的大小和形状与很多因素有关,既取决于表面活 性剂和溶剂的种类和浓度,也取决于温度、压力、离子强 度、表面活性剂和溶剂的浓度等因素。典型的水相中胶 团内的聚集数是50~100,其形状可以是球形、椭球形或是 棒状。反胶团直径一般为5~20nm,其聚集数通常小于50,通 常为球 形,但在某些情况下,也可为椭球形或棒状。 实验中观察到,对于大多数表面活性剂,要形成胶团,存 在一个临界胶团浓度(CMC),即要形成胶团所必需的表面 活性剂的最低浓度。低于此值则不能形成胶团。这个数 值可随温度、压力、溶剂和表面活性剂的化学结构而改 变,一般为0.1~1.0mmol/L。