磁性纳米铁治疗大鼠胶质瘤的实验研究

磁性纳米铁治疗大鼠胶质瘤的实验研究(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ )【摘要】目的：研究局部使用磁性纳米铁热疗对大鼠胶质瘤的治疗效果。

方法：将传代培养的C6细胞立体定向接种于SD 大鼠的尾状核,14 d后肿瘤生长至直径0.5 ~ 1.0 cm时随机分成对照组和3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组，分别立体定向注入等体积的生理盐水及3、5、8 mg的磁性纳米铁,于交变磁场中连续热疗3次,每次30 min,观察大鼠的生存时间及肿瘤体积变化。

免疫组织化学SP法检测bcl]2和bax蛋白表达。

结果：肿瘤热疗3次后3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组大鼠的生存时间分别为(19.60 ±1.43)、(18.90 ±.75)、(20.40 ±2.26) d,明显长于对照组](13.30 ±1.69) d , P V 0.05 ],各剂量磁性纳米铁热疗组bax蛋白表达亦明显强于对照组，差异有统计学意义(均P V0.05);各剂量磁性纳米铁热疗组间bax蛋白表达、bcL2 蛋白表达及生存时间比较差异无统计学意义(均P >0.05)。

结论:磁性纳米铁热疗能有效地促进大鼠胶质瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，延长荷瘤鼠的生存期。

磁性纳米铁热疗能促进bax蛋白的表达，对bcd2蛋白表达影响不明显。

【关键词】胶质瘤；纳米铁；热疗；凋亡[Abstract] Objective: To explore the efficacy of magn etic nano [iron hyperthermia on rat glioma. Methods: C6 cells were injected in the SD rat caudate nu cleus by means of subculture of stereotactic ino culati on. After 14 days whe n the glioma had growed to 0.5 〜1.0 cm in diameter, the rats were divided in to four groups ran domly and the n the magn etic nano Jir on(3, 5, 8 mg ) or an equal volume of physic Jological saline were injected respectively. After finishing the magnetic nano ]iron treatment for three times in alternating magnetic field and keeping 30 min for each time, the survival time of rats and the change of tumor volume were observed and the protein expression of bcl[2 and bax were detected by the method of im muno histochemistry SP. Results: The survival time of rats in the magheticnano iron 3, 5, 8 mg groups was(19.60 ±1.43) days,(18.90±1.75) days,(20.40 ±2.26) days, respectivety. Which were significantly higher than that of control group [ (13.30 ±1.69) days,P v 0.05 ] . The expression of bax protein in the magheticnano ]iron groups was also significantly stronger than that of control group(all P v 0.05). The expression of bax protein, bcl_2 protein and the survival time among the treatment groups had not difference(all P > 0.05). Conclusions: Magneticnano [iron hyperthermia can effecttively promote cell apoptosis in ratglioma, i nhibit tumor proliferati on and prolong the survival time of tumor beari ng rat. Magn etic nano ]ir on hyperthermia can promote the expressi on of bax prote in, but the bcl ]2 expressi on of prote in is not obvious .[Key words] glioma ; nano[iron ; hyperthermia ; apoptosis胶质瘤(glioma)起源于神经外胚层，是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤(平均占44.69%) : 1 ]。

由于生长位置特殊、恶性程度高以及血脑屏障的存在，临床上胶质瘤治疗效果极差。

近来研究发现，胶质瘤对热疗敏感。

作者在建立大鼠胶质瘤脑内模型的基础上，通过立体定位向肿瘤内注入不同剂量的磁性纳米铁进行热疗，并与对照组进行比较,探讨磁性纳米铁热疗是否可以使肿瘤缩小、延长荷瘤鼠的生存期以及磁性纳米铁热疗是否能够影响bax、bcl]2蛋白表达、促进肿瘤细胞凋亡。

1材料与方法1.1材料SD健康大鼠80只,体重280〜300 g,雌雄不限，购于东南大学动物实验中心。

大鼠C6胶质瘤细胞株购于中国科学院上海生物研究所，大鼠bax、bcl_|2蛋白单克隆抗体为美国Santa Cruz产品，交变磁场机器及磁性纳米铁颗粒(15 nm)由东南大学生物医学工程系提供。

1.2方法1.2.1 C6胶质瘤细胞培养细胞分装于底面积为50 cm2的培养瓶中,加入适量体积分数为2.5%胎牛血清、15%马血清的F 12K培养液,置于温度为37 C、体积分数为5%的CO2恒温恒湿培养箱中，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数，在细胞对数生长期培养瓶大约满85%时，以0.25%胰酶消化(不含EDTA),收集消化液，离心后去除上清液，F］12k液洗2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为］1X107(10 好1〜1 X108 (10 心1］, 置于37 C恒温摇床待接种；苔盼蓝排斥实验检测显示细胞活力〉95%。

1.2.2胶质瘤细胞脑内原位接种用1%的戊巴比妥钠按照］0.4 ml (100 g)-1 ］剂量行腹腔注射麻醉后，将大鼠头部固定在脑立体定向仪上，剪去头顶部毛发，碘酒、乙醇消毒后铺孔巾。

内眦连线与头部正中定位仪引导下根据Batker 法确定右尾状核靶点，于冠状缝前1 mm、中线右旁开3 mm处用圆头牙科钻钻一孔径约1.2 mm的小孔，深达硬脑膜表面但不伤及脑组织；以25 4微量注射器抽取10山单细胞悬液,沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下6 mm,再回退1 mm,以1 4 min-1的注射速度匀速缓慢注射10 “肿瘤细胞，注射完毕后留针5 min,缓慢拔针,骨蜡封闭骨孔。

生理盐水冲洗手术野，皮肤消毒后4号线缝合切口。

123胶质瘤生长观察及体积大小的评估接种后每2 d行MRI扫描，观察肿瘤大小及生长情况，测量肿瘤的最大长径（a）和最大宽径（b）,计算肿瘤体积（V=a旳2/2）;接种14 d 后肿瘤直径为0.5 ~ 1.0 cm时随机将80只大鼠分成生理盐水对照组及3、5、8 mg磁性纳米铁热疗组4组,每组20只。

1.2.4磁性纳米铁瘤内注入大鼠麻醉成功后将头部固定于立体定向仪上，剃毛、消毒、铺巾。

原切口切开头皮，寻找到原骨孔，以50山微量注射器分别抽取30山等体积的生理盐水及3、5、8 mg磁性纳米铁立体定向注入相应的瘤区，行MRI扫描确认注入部位准确。

1.2.5胶质瘤热疗交变磁场选择频率40 kHz,功率80 kW,磁感应强度0〜100 kA m-1,连续热疗3 d,每日1次，持续时间为30 min。

热疗结束后第2 天每组取10只大鼠处死，取标本行光镜、免疫组织化学检测，余40只大鼠分笼饲养，观察生存时间并做好死亡记录。

1.2.6光镜检查大鼠处死后，无菌条件下迅速取出脑组织，分别固定于10%多聚甲醛,4 C冰箱固定24 h后，脱水、石蜡包埋、切片后染色，光镜下观察瘤区的细胞形态及密度。

1.2.7免疫组织化学染色肿瘤组织5 g厚切片,常规脱蜡后水化，再经0.01% mol L-1 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）于微波炉内处理15 min,然后加入一抗bcl]2 和bax,4 C冰箱孵育12 h;具体染色步骤严格按SP试剂盒说明进行。

DAB显色,细胞核作苏木素衬染。

阳性对照由南京凯基公司提供，阴性对照采用缓冲液代替一抗。

Bax与bcl]2结果判断：肿瘤细胞中bax 蛋白表达位于胞浆，胞浆中出现高出背景棕黄色的为阳性细胞；而肿瘤细胞中bcl]2蛋白表达位于胞膜或胞浆内，细胞膜或胞浆出现棕黄色为阳性细胞。

于400倍显微镜下计数1 000个细胞中的凋亡细胞，计算凋亡指数（apoptosis index, AI）,AI=凋亡细胞数/1 000 X100%。

1.3统计学处理实验测定数据用x- ±s表示，多样本均数比较采用方差分析，利用SPSS统计分析软件处理各组数据，以P V 0.05为差异有统计学意义。

2结果2.1各组大鼠胶质瘤MRI表现大鼠接种后13 d MRI扫描显现肿瘤直径可达到0.5〜0.8 cm,位于尾状核；立体定向注射磁性纳米铁颗粒连续热疗3次后,复查MRI显示瘤体缩小，脑水肿减轻，中线归位,磁性纳米铁位于瘤区（图1、2)2.2各组大鼠脑内胶质瘤生长曲线根据测量计算得出的肿瘤体积(V=a >4)2/2),绘制生长曲线(图3)。

从图3可以看出，随瘤龄延长对照组瘤体明显增大，磁性纳米铁热疗组瘤体缩小，磁性纳米铁热疗组与对照组肿瘤体积比较差异有统计学意义(P V 0.05),各剂量磁性纳米热疗组间肿瘤体积比较差异无统计学意义(P >0.05)。